慢性束縛應(yīng)激對(duì)小鼠食管上皮細(xì)胞間距增寬及炎癥發(fā)生的研究

買買提·依斯熱依力 趙新勝 艾克拜爾·艾力 李義亮 阿孜古麗·阿力木江賽米·賽麥提 閆晶 克力木·阿不都熱依木

胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是消化系統(tǒng)常見的疾病，其發(fā)生發(fā)展與心理因素密切相關(guān)。焦慮和抑郁等心理疾病增加罹患GERD的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致GERD癥狀的加重［1］。食管上皮的通透性取決于緊密連接（tight junction，TJ）蛋白的完整性。研究發(fā)現(xiàn)，食管黏膜暴露于酸或酸化的胃蛋白酶環(huán)境會(huì)使TJ蛋白破壞，從而造成細(xì)胞旁通路對(duì)水、電解質(zhì)和小分子物質(zhì)的通透性增加，導(dǎo)致食管鱗狀上皮出現(xiàn)細(xì)胞間隙增寬（dilated intercellular space，DIS）［2］。GERD患者食管上皮TJ蛋白表達(dá)異常可直接導(dǎo)致食管上皮DIS，這一組織學(xué)變化也許能作為GERD食管形態(tài)超微結(jié)構(gòu)異常的客觀指標(biāo)［3］。這可能是部分難治性GERD患者使用質(zhì)子泵抑制劑（proton pump inhibitors，PPI）治療后，癥狀仍持續(xù)存在的原因之一。國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，活性氧（reactive oxygen species，ROS）在許多疾病發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，也被認(rèn)為是GERD、Barrett食管的發(fā)病重要機(jī)制之一［4］。因此，本研究通過建立小鼠慢性束縛應(yīng)激（Stress）模型，探討心理應(yīng)激對(duì)食管ROS、抗氧化蛋白、TJ蛋白以及炎癥發(fā)生的作用。

材料與方法

一、對(duì)象

8周齡，SPF級(jí)雄昆明小鼠20只，購(gòu)于新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，許可證號(hào)：SCXK（新）2011-0001；實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所IVC系統(tǒng)動(dòng)物中心。全例小鼠采用Microsoft Office Excel軟件隨機(jī)分2組（每組10只），即慢性束縛應(yīng)激組和對(duì)照組。小鼠單只飼養(yǎng)在自由進(jìn)食水的鼠籠內(nèi)，每日給予12 h晝夜循環(huán)，光照均始于8：30分，止于20：30分。

二、方法

1.Stress模型的建立：造模方法，參照我們的前期研究［5-7］，大體實(shí)驗(yàn)步驟如下；10只慢性束縛應(yīng)激組小鼠置于用50 ml離心管所制的自制式束縛器中（離心管提前燙制出直徑約5 mm的通氣孔若干，分布于左右及上側(cè)管壁，管口塑料蓋做1小孔以暴露小鼠尾巴），束縛應(yīng)激均在每日上午10：30～12：30進(jìn)行，每日限制活動(dòng)2 h，期間禁食禁水，后放回鼠籠內(nèi)自由活動(dòng)，連續(xù)束縛14 d。對(duì)照組小鼠自由飲水?dāng)z食，其余時(shí)間2組小鼠處理相同。

2.取材與標(biāo)本處理：束縛應(yīng)激第14天下午17：00開始對(duì)2組小鼠均進(jìn)行禁食，于次日上午11：00進(jìn)行取材。麻醉的小鼠以平臥位固定，從腹部正中至劍突取切口取3 cm切口，下腔靜脈取血注入于1.5 ml EP管中。在距離胃食管交界處0.3 cm處和1.5 cm處剪斷取材，置于4%中性甲醛固定。

3.食管組織病理學(xué)檢查：食管標(biāo)本4%中性甲醛固定24 h后水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4 μm厚切片行H&E染色。

4.間隙測(cè)量：2組食管組織常規(guī)HE染色后，光學(xué)顯微鏡（油鏡）下放大1000倍，并在不同部位上拍攝10張光鏡照片，使用Image J等圖像處理軟件數(shù)字化測(cè)量細(xì)胞間隙。

5.實(shí)時(shí)定量RT-PCR：采用實(shí)時(shí)定量（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）方法檢測(cè)Nox-4、核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（Nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf-2）、血紅素氧合酶-1（Heme oxygenase，HO-1）、閉合蛋白-1（Claudin-1）、閉合蛋白-4（Claudin-4）、咬合蛋白（Occludin）及胞質(zhì)緊密黏連蛋白-1（Zonula occludens， ZO-1）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（Monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）以及腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor α，TNF-α）的指標(biāo)的mRNA表達(dá)。取每只小鼠食管組織25 mg，采用TRIzol試劑提取總RNA，采用天根公司Fast Quant RT試劑盒合成第1鏈cDNA。由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成引物，各指標(biāo)及β-肌動(dòng)蛋白（actin）引物序列見表1。RT-PCR反應(yīng)嚴(yán)格按照本研究組前期研究以及試劑盒操作說明進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后由電腦自動(dòng)得出熒光曲線及CT值，采用2-△△CT計(jì)算出目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。

6.酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測(cè)定：取血后不經(jīng)任何處理，4℃下靜置2 h，之后以3500 rpm/min的速度低溫離心5 min，取上層血清，-80℃保存，用于后續(xù)測(cè)定。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測(cè)血清中NADPH氧化酶-4（NADPH oxidase-4，Nox-4）、8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG）及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的含量。實(shí)驗(yàn)過程及測(cè)量指標(biāo)濃度的計(jì)算嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料均以（±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Stress對(duì)小鼠食管上皮細(xì)胞間距增寬的影響

對(duì)照組小鼠食管上皮細(xì)胞鏡下測(cè)量的平均細(xì)胞間隙為（0.64±0.04）μm，慢性束縛應(yīng)激組（1.16±0.02）μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.63，P＜0.05）。見圖1。

二、Stress對(duì)食管氧化應(yīng)激的影響

ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，慢性束縛應(yīng)激組小鼠血液中Nox-4［（9.72±1.80）ng/mlvs（4.54±0.46）ng/ml］、8-OHdG［（4.94±0.58）ng/mlvs（1.44±0.16）ng/ml以及MDA（3.56±0.41）ng/mlvs（1.02±0.12）ng/ml］的釋放濃度明顯高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=25.54，19.62，13.67，P均＜0.05）。見圖2。

三、Stress對(duì)食管抗氧化蛋白的影響

抗氧化蛋白的RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢性束縛應(yīng)激組食管組織中Nrf-2和HO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-10.36，-9.28，P＜0.05）。見圖3。

表1 實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物序列

圖1 2組食管上皮細(xì)胞間隙測(cè)量

圖2 2組食管組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的mRNA表達(dá)情況

四、Stress對(duì)食管TJ蛋白的影響

2組小鼠食管組織TJ蛋白重要指標(biāo)的RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢性束縛應(yīng)激組TJ蛋白如Claudin-1、Claudin-4、Occludin及ZO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-10.23、-9.65、-7.81、-8.75，P＜0.05）。見圖4。

五、Stress對(duì)食管炎癥因子的影響

2組小鼠食管組織炎癥因子指標(biāo)的RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢性束縛應(yīng)激組炎癥因（MCP-1、IL-1β、TNF-α）的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=31.42、42.37、46.83，P＜0.05）。見圖5。

圖3 2組食管氧化蛋白的mRNA表達(dá)情況

圖4 2組食管組織TJ蛋白的mRNA表達(dá)情況

圖5 2組食管組織炎癥因子的mRNA表達(dá)情況

討 論

食管黏膜防御功能主要由上皮屏障構(gòu)成，任何一種或多種防御機(jī)制的缺陷均可導(dǎo)致食管對(duì)胃內(nèi)容物（胃酸）清除能力降低，繼而引起食管上皮損傷，食管上皮TJ蛋白的表達(dá)下降是其重要發(fā)生機(jī)制［8］。食管鱗狀上皮對(duì)酸性胃液非常敏感。GERD患者在長(zhǎng)期持續(xù)的胃液刺激下，食管下段的黏膜發(fā)生炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞增生以及DIS等一系列的改變［9］。研究發(fā)現(xiàn)，酸反流無明顯的GERD患者與健康對(duì)照組患者相比食管上皮DIS非常明顯，反流性食管炎和非糜爛性食管炎患者均存在不同程度的食管上皮的DIS［10］。當(dāng)食管上皮DIS持續(xù)存在時(shí)，伴隨H＋過多彌散入細(xì)胞胞漿和細(xì)胞間隙，碳酸氫鹽等化學(xué)屏障不能夠緩沖H＋時(shí)，H＋刺激細(xì)胞間隙的酸敏感傷害感受器，導(dǎo)致燒心癥狀的產(chǎn)生［11］。

GERD是一種多疾病癥候群而非單一的發(fā)病機(jī)制所致，反流癥狀（燒心、疼痛）會(huì)嚴(yán)重影響患者的精神和心理狀態(tài)。心理應(yīng)激是機(jī)體在受到心理、環(huán)境及生理性應(yīng)激源刺激時(shí)所出現(xiàn)的非特異性全身反應(yīng)。焦慮、抑郁等心理應(yīng)激與食管高敏感性有著較密切的聯(lián)系［12］。國(guó)外的研究者，在心理壓力大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，壓力后大鼠無出現(xiàn)明顯的酸反流，而食管上皮細(xì)胞間隙出現(xiàn)明顯的增寬、通透性增加以及酸敏感受體的大量表達(dá)等現(xiàn)象［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，接受為期2周的心理應(yīng)激后小鼠出現(xiàn)食管上皮的DIS（1.16±0.02）μm，與對(duì)照組（0.64±0.04）μm相比，存在明顯的差異。

心理壓力增高是誘導(dǎo)ROS發(fā)生的重要機(jī)制，而ROS也在GERD、Barrett食管和腺癌等諸多疾病的進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用［14］。細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過量的ROS就能引起生物膜脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞內(nèi)蛋白及酶變形，DNA損害，最后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，組織氧化損傷。ROS與促炎癥細(xì)胞因子常常在炎癥部位同時(shí)存在，ROS能上調(diào)促炎癥因子的基因表達(dá)水平，同時(shí)，促炎癥細(xì)胞能誘導(dǎo)ROS的生成，兩者形成正反饋環(huán)［15］。國(guó)外研究者發(fā)現(xiàn)，反流大鼠模型中，GERD發(fā)病機(jī)制由內(nèi)源性ROS過度產(chǎn)生有關(guān)的，使用抗氧化劑后發(fā)現(xiàn)食管組織ROS的產(chǎn)生被抑制，黏膜炎癥發(fā)生同時(shí)也得到了有效的控制［16］。ROS參與食管黏膜的損傷過程，激活細(xì)胞內(nèi)核因子Kappa B（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號(hào)傳導(dǎo)通路并促進(jìn)炎癥因子如白細(xì)胞介素-8（IL-8）和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平，使炎癥效應(yīng)繼續(xù)擴(kuò)大，食管黏膜的損傷不斷加重［17］。NADPH氧化酶（NADPH oxidase，Nox）為細(xì)胞內(nèi)一組具有氧化活性的酶復(fù)合體，是主要的ROS來源，有6個(gè)同源物（Nox-1， Nox-3， Nox-4， Nox-5， DUOX1，DUOX2），其中Nox-4與ROS關(guān)系較密切的氧化酶［18］。8-OHdG的形成是反應(yīng)組織DNA氧化損傷和致癌的重要生物標(biāo)記物（Bio-marker）。ROS的代謝產(chǎn)物MDA和不飽和醛引起蛋白質(zhì)交聯(lián)，使蛋白質(zhì)失去功能，還具有致突變，致癌活性等作用［19］。這些重要ROS標(biāo)記物在食管組織中表達(dá)及上皮細(xì)胞DIS發(fā)生中的意義仍需進(jìn)一步的研究。

細(xì)胞內(nèi)同時(shí)具有幾種抗氧化蛋白體系，例如；Nrf-2以及下游基因HO-1是細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御的重要蛋白，能防止活性氧的損傷作用［20］。Nrf-2/HO-1通路調(diào)控組織或細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性解毒酶及抗氧化應(yīng)激酶的表達(dá)［21］。Chen等［22］研究發(fā)現(xiàn)，Nrf-2基因敲除小鼠出現(xiàn)胃酸反流并導(dǎo)致食管及胃底角化，Nrf-2缺乏進(jìn)一步減少了被回流抑制的單層細(xì)胞的跨膜電阻值，從而引起食管DIS、黏膜損傷并使得食管上皮屏障功能異常。因此，機(jī)體受到心理應(yīng)激作用導(dǎo)致ROS產(chǎn)生過多，超出機(jī)體氧化物的清除能力，使氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，而引起氧化損傷的加重。本研究結(jié)果顯示，Stress小鼠食管組織中ROS重要指標(biāo)（Nox-4、8-OHdG、MDA）和抗氧化蛋白（Nrf-2、HO-1）的mRNA表達(dá)以及血液中的釋放濃度與對(duì)照組相比，存在明顯的差異，證實(shí)了心理應(yīng)激可誘導(dǎo)食管組織ROS的過量表達(dá)和抗氧化蛋白的降低。更重要的是，心理應(yīng)激后小鼠食管上皮TJ蛋白指標(biāo)（Claudin-1、Claudin-4、Occludin、ZO-1）以及促炎癥因子（MCP-1、IL-1β、TNF-α）的mRNA表達(dá)量，與對(duì)照組相比，存在明顯的差異。因此，我們認(rèn)為氧化/抗氧化防御系統(tǒng)的平衡在維持食管黏膜穩(wěn)態(tài)及屏障中發(fā)揮著重要的作用。

綜上，食管黏膜的損傷，酸反流，食管動(dòng)力學(xué)的改變等都不能完全全面地解釋GERD燒心、胸痛的癥狀的發(fā)生［23］。以DIS為代表的食管上皮屏障破壞，可使迷走神經(jīng)末梢暴露，引起其對(duì)各種刺激的反應(yīng)敏感化，甚至使分布于黏膜上層內(nèi)的神經(jīng)突起產(chǎn)生興奮，從而導(dǎo)致軸突末梢釋放神經(jīng)遞質(zhì)，直接引起食管感覺異常及疼痛反應(yīng)［24］。本研究前期的工作中發(fā)現(xiàn)，不同亞型GERD（非糜爛性反流病、反流性食管炎）患者中酸反流可激活致敏指標(biāo)（TRPV-1、PAR-2）受體，進(jìn)而引起食管高敏感性產(chǎn)生［25］。結(jié)合我們前期研究和根據(jù)本研究結(jié)果，我們認(rèn)為心理壓力使食管氧化、抗氧化防御系統(tǒng)受損，進(jìn)而出現(xiàn)食管上皮存在的TJ蛋白結(jié)構(gòu)和功能的異常，可能是GERD發(fā)病機(jī)制之一。然而，那些有GERD癥狀而無酸反流的患者癥狀產(chǎn)生機(jī)制尚未清楚，心理壓力與食管超微結(jié)構(gòu)改變的確切的機(jī)制也待進(jìn)一步研究明確。