一株生防真菌TRCC27001的鑒定及其抑菌特性

于地美, 黃華毅,2, 梁小文, 李肖宇, 田呈明

(1.北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室，北京 100083；2.廣東省林業(yè)科學(xué)研究院， 廣東 廣州 510520；3.江西天人生態(tài)股份有限公司，江西 吉安 343100)

由植物病原真菌引起的一系列植物病害對農(nóng)業(yè)和林業(yè)的發(fā)展具有較大影響，會造成較大的生態(tài)危害和經(jīng)濟損失.化學(xué)藥劑對植物病害的防效高且見效快，是防治各種植物病害的主要手段；但長期使用化學(xué)藥劑會導(dǎo)致環(huán)境污染、病原菌抗藥性增強、成本升高以及農(nóng)藥殘留等問題[1].因此，發(fā)展環(huán)保且高效的替代防治方法逐漸成為植物病害研究的重要方向之一.

生防微生物在植物病害防治中表現(xiàn)出良好的防控效果以及生態(tài)安全性，具有較大的開發(fā)應(yīng)用潛力[2].用于防治植物病害的生防微生物種類很多，最常見的為真菌類、放線菌類和細菌類[3].其中，真菌中的哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、綠色木霉(T.viride)、康氏木霉(T.koningii)、叢枝菌根(Arbuscularmycorrhiza)、粘帚霉(Gliocladiumspp.)等已在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[4-5].木霉菌是全球研究和應(yīng)用最多的生防真菌之一，有100多種含木霉菌的生物制劑在多個國家得到廣泛使用[6].

目前，對于生防真菌的鑒定主要依靠形態(tài)學(xué)觀察和基因序列分析.常見的用于真菌分子鑒定的序列有ITS、Tef 1-α、cal等[7].對木霉的鑒定以多基因結(jié)合的方式為主，常用ITS序列和Tef 1-α基因結(jié)合進行分子生物學(xué)分析.本研究將對菌株TRCC27001進行鑒定，并測定其對多種常見林業(yè)、農(nóng)業(yè)病原真菌的抑制能力和篩選其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，以期為該菌株在植物病害生物防治中的實際應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 生防真菌TRCC27001，由江西天人生態(tài)股份有限公司提供.植物病原真菌包括立枯絲核菌(Rhizoctorziasolani)、金黃殼囊孢(Cytosporachrysosperma)、禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)、楊樹炭疽菌(Colletotrichumpopuli)、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、毛霉(Mucorsp.)、犁頭霉菌(Absidiasp.)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)、黑腐皮殼菌(Cytosporaambiens)、細極鏈格孢(Alternariatenuissima)，均由中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供.

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂粉17 g)，PDB培養(yǎng)基為不加瓊脂粉的PDA培養(yǎng)基，膠霉毒素培養(yǎng)基(葡萄糖25 g，酒石酸銨2 g，F(xiàn)eSO40.01 g，MgSO4·7H2O 1 g，蒸餾水1 000 mL)，麥芽浸膏培養(yǎng)基(麥芽浸膏30 g，大豆蛋白胨3 g，無水葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL)，察氏培養(yǎng)基(蔗糖30 g，NaNO33 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO41 g，蒸餾水1 000 mL)，YEMEA 1(酵母膏10 g，麥芽膏10 g，葡萄糖4 g，蒸餾水1 000 mL)，麩皮培養(yǎng)基[麩皮36 g，(NH4)2HPO410 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g， 蒸餾水1 000 mL]，燕麥培養(yǎng)基[(燕麥片20 g，微量元素溶液1 mL(FeSO4·7H2O 1 g·L-1, MnCl2·4H2O 1 g·L-1, ZnSO4·7H2O 0.1 g·L-1)，蒸餾水1 000 mL]，CMD培養(yǎng)基(玉米粉30 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL).

1.2 生防菌TRCC27001對多種植物病原真菌拮抗效果的測定

通過平皿對峙法[8]檢測生防菌TRCC27001對多種植物病原真菌的拮抗效果.在直徑90 mm的PDA平板上距中心3 cm的相對位置處，分別接種直徑6 mm的病原菌和生防菌菌餅，每個處理重復(fù)3次，倒置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).以病原菌的單獨培養(yǎng)作為對照，每24 h觀測菌落縱橫半徑.計算培養(yǎng)96 h后菌株TRCC27001對病原菌絲生長的抑制率，以及生防菌株與病原菌之間的相對抑制率[9].

菌落生長抑制率/%=(病原菌對照組菌落半徑-對峙培養(yǎng)病原菌落指向生防真菌的半徑)/病原菌對照組菌落半徑×100；

生防菌被抑制率/%=(生防真菌對照組菌落半徑-對峙培養(yǎng)生防真菌指向病原菌落的半徑)/生防真菌對照組菌落半徑×100；

相對抑菌率=菌落生長抑制率/生防菌被抑制率.

1.3 生防菌TRCC27001最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

1.3.1 生防菌的發(fā)酵培養(yǎng) 生防菌株TRCC27001的發(fā)酵培養(yǎng)基為培養(yǎng)絲狀真菌及木霉屬菌株的7種常見培養(yǎng)基.其中，制作燕麥片培養(yǎng)基時需先將燕麥60 ℃水浴1 h，再用4層紗布過濾.發(fā)酵培養(yǎng)的具體方法：取生防菌TRCC27001的新鮮菌絲塊(6 mm)5塊，接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶(500 mL)中，25 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)10 d；將發(fā)酵培養(yǎng)液于10 000 r·min-1、4 ℃條件下離心,取上清液，用孔徑0.45 μm的濾膜過濾除菌，得到無菌發(fā)酵液.

1.3.2 生防菌無菌發(fā)酵液的抑菌活性檢測 將TRCC27001無菌發(fā)酵液與加熱冷卻至40～50 ℃的PDA以1∶10(v/v)的比例混合，倒平板，在平板中央分別接入新鮮的金黃殼囊孢菌餅(6 mm)，25 ℃倒置培養(yǎng)，每隔一天采用十字交叉法測量病原菌落直徑，直至對照組菌落即將長滿平皿為止.以不加TRCC27001無菌發(fā)酵液的平板作為對照，每個處理設(shè)3個重復(fù)，計算相對抑菌率[10].

相對抑菌率/%=(對照組擴展直徑-處理組擴展直徑)/對照組擴展直徑×100.

1.4 生防菌TRCC27001無菌發(fā)酵液的活性穩(wěn)定性分析

以金黃殼囊孢為指示菌，分別測定采用麩皮發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后的菌株TRCC27001無菌發(fā)酵液在不同酸堿度、溫度及輻射時間下的抑菌活性.供試的生防菌無菌發(fā)酵液制備后于4 ℃保存?zhèn)溆?每個處理均設(shè)3次重復(fù)，以未經(jīng)處理的發(fā)酵液混合培養(yǎng)基培養(yǎng)金黃殼囊孢作為對照組，計算相對抑菌率.

相對抑菌率/%=(未混合無菌發(fā)酵液組的培養(yǎng)菌落擴展直徑-處理組菌落擴展直徑)/(未混合無菌發(fā)酵液組的培養(yǎng)菌落擴展直徑-對照組菌落擴展直徑)×100.

1.4.1 不同pH處理下的穩(wěn)定性 取適量生防菌無菌發(fā)酵液，用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH分別將其調(diào)成不同pH值，4 ℃放置30 min，再將各樣品的pH值調(diào)回中性后，檢測各處理無菌發(fā)酵液的抑菌活性.以不經(jīng)酸、堿處理的原樣品為對照.

1.4.2 不同溫度處理下的穩(wěn)定性 取適量生防菌無菌發(fā)酵液分別于5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、105 ℃條件下處理30 min.以4 ℃放置的無菌發(fā)酵液為對照，檢測各處理無菌發(fā)酵液的抑菌活性[11].

1.4.3 不同輻射時間下的穩(wěn)定性 將適量無菌發(fā)酵液倒入無蓋的培養(yǎng)皿中，用磁力攪拌器緩慢攪拌，并置于30 W的紫外燈下分別照射0.5、1.0、1.5、2.0 h后，檢測各處理無菌發(fā)酵液的抑菌活性.對照組為未經(jīng)紫外線輻射的原樣品[12].

1.5 生防菌TRCC27001的鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 采用Jaklitsch[13]的觀測指標，結(jié)合孫瑞艷等[14]的描述方式對菌株TRCC27001的形態(tài)進行鑒定.

1.5.2 分子生物學(xué)鑒定 將生防菌TRCC27001用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，用CTAB提取法提取其基因組DNA.利用通用引物對ITS1/ITS4擴增ITS片段，ITS1序列為5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4序列為5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[15].采用Tef 1-α擴增引物EF1T(5′-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3′)(SEQ ID NO.3)、EF2T(5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′)(SEQ ID NO.4)進行PCR擴增，獲得Tef 1-α基因序列[16].PCR擴增反應(yīng)體系：10×PCR buffer(10 mmol·L-1Tris/HCl pH 8.0, 50 mmol·L-1KCl, 1.5～2.0 mmol·L-1MgCl2)，dNTP mix 4 μL，上、下游引物各10 pmol，Taq聚合酶0.5 μL，DNA模板2 μL，加ddH2O至50 μL.PCR擴增循環(huán)條件：94 ℃加熱3 min使模板DNA 變性；然后94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共進行35個循環(huán)；最后在72 ℃延伸5 min，4 ℃保溫.PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在波長365和254 nm的紫外光下檢測為明顯單一條帶的產(chǎn)物，由擎科生物技術(shù)有限公司純化后用ABI3700進行雙向直通測序.測得的原始序列采用Bioedit 7.0.9編輯后得到準確序列，經(jīng)BLAST進行序列比對，得到相似度較高的菌株種類，并與GenBank上的菌株序列組成序列矩陣，再使用最大簡約(maximum parsimony,MP)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010和SPSS 20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，對不同處理組間的結(jié)果進行單因素方差分析，應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法檢驗差異顯著性.

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌TRCC27001對多種植物病原真菌的拮抗效果

生防菌TRCC27001對12種常見植物病害的病原真菌均有一定的拮抗效果.培養(yǎng)24 h時，菌株TRCC27001對金黃殼囊孢、禾谷鐮刀菌、毛霉、楊樹炭疽菌、細極鏈格孢沒有抑菌效果，24 h后抑菌率逐漸上升；對葡萄座腔菌、黑腐皮殼菌、立枯絲核菌、犁頭霉菌、尖孢鐮刀菌以及大麗輪枝菌等病原菌在培養(yǎng)24 h時即表現(xiàn)出一定抑菌效果，之后抑菌效果逐漸增強直至相對穩(wěn)定.培養(yǎng)96 h時，生防菌TRCC27001對各病原真菌的生長抑制率和相對抑菌率如表1所示.此時，生防菌落與12種病原真菌菌落均相接，當(dāng)生防菌與病原菌完全接觸后，繼續(xù)向病原菌方向生長，包圍和覆蓋部分病原菌落；病原菌落被包圍后停止生長，且出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象.對峙培養(yǎng)168 h時，在與大麗輪枝菌、葡萄座腔菌、黑腐皮殼菌、立枯絲核菌以及毛霉的對峙平板上，生防菌落已布滿平皿；在與金黃殼囊孢、禾谷鐮刀菌、楊樹炭疽菌、膠孢炭疽菌、犁頭霉菌、尖孢鐮刀菌以及細極鏈格孢的對峙平板上，生防菌落占據(jù)大半個平皿，病原菌落周圍萎縮，部分平皿上出現(xiàn)明顯的抑菌帶和菌絲消解痕跡.平皿上生防菌氣生菌絲發(fā)達，形成大量的綠色分生孢子堆(圖1)，對峙作用基本停止.這表明生防菌TRCC27001競爭系數(shù)高，在與病原菌的對峙培養(yǎng)中，能迅速占領(lǐng)生態(tài)位，抑制病原菌生長.

表1 培養(yǎng)96 h時菌株TRCC27001對12種病原真菌的抑制效果1)Table 1 Inhibition effects of strain TRCC27001 on 12 pathogenic fungi after 96 h

1)數(shù)據(jù)為平均值±標準差.同列數(shù)據(jù)后附不同字母者表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).

左側(cè)平皿為對照組；右側(cè)平皿為TRCC27001與病原真菌的對峙培養(yǎng)，其中平皿左側(cè)為病原菌，右側(cè)為生防菌TRCC27001.圖1 培養(yǎng)168 h時菌株TRCC27001與12種病原真菌的平皿對峙效果Fig.1 Dual-culture effects between strain TRCC27001 and 12 pathogenic fungi after 168 h

2.2 生防菌TRCC27001最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

利用麩皮培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)后，TRCC27001的無菌發(fā)酵液對金黃殼囊孢的抑菌能力最強(圖2)，相對抑菌率達79.40%；經(jīng)膠霉毒素培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)獲得的無菌發(fā)酵液的抑菌能力最小，相對抑菌率僅為29.79%(圖3).

2.3 生防菌TRCC27001無菌發(fā)酵液的活性穩(wěn)定性

菌株TRCC27001無菌發(fā)酵液分別經(jīng)過0.5、1.0、1.5和2.0 h的紫外線輻射后，仍對金黃殼囊孢保持良好的抑菌活性(圖4A)，指示菌的菌落直徑保持在23 mm內(nèi)；菌株TRCC27001的無菌發(fā)酵液經(jīng)過不同溫度處理30 min或在強酸和強堿條件下也均能保持良好的抑菌活性(圖4B、4C).這說明菌株TRCC27001的無菌發(fā)酵液具有很強的抗逆性.

A.對照組；B.處理組.圖2 經(jīng)麩皮培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)的TRCC27001無菌濾液對金黃殼囊孢的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of TRCC27001 sterile fermentation broth cultured on wheat bran medium against Cytospora chrysosperma

柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05).圖3 發(fā)酵培養(yǎng)基對TRCC27001無菌發(fā)酵液抑菌能力的影響Fig.3 Influences of fermentation mediums on the inhibitory activity of TRCC27001 sterile fermentation broth

圖4 輻射時間(A)、溫度(B)和pH(C)對無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.4 Effects of UV-irradiation time (A), temperature (B) and pH (C) on the inhibitory activity of sterile fermentation broth

2.4 生防菌TRCC27001的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，純化的生防真菌TRCC27001菌落在PDA平板上為圓形，生長初期菌絲為白色，氣生菌絲少，25 ℃下培養(yǎng)48～72 h后，產(chǎn)生不定型棉絮狀白色氣生菌絲，分生孢子梗形成小皰，后期氣生菌絲呈現(xiàn)同心輪紋狀(圖5A).生防真菌菌落在CMD平板上為圓形，生長初期菌絲與PDA平板上狀態(tài)相似，幾乎無氣生菌絲，25 ℃下培養(yǎng)48 h后，開始形成分生孢子，后期出現(xiàn)明顯的分生孢子堆，匯合成寬的灰綠色同心輪紋(圖5B、5C).PDA平板上菌落背面開始時無色，后期呈暗黃色.顯微鏡下觀察，菌絲無色纖細，具分隔，多分枝；分生孢子梗從菌絲的側(cè)枝上生出，一般具有2～3個輪生的分枝，瓶梗安瓿形，單生或?qū)ι?，輪枝狀排?圖5D).大多數(shù)分生孢子為卵圓形或亞球形，壁光滑(圖5E、5F).

以菌株TRCC27001基因組DNA為模板，用ITS序列通用引物擴增出一條長度為616 bp的序列，并用Tef 1-α序列通用引物擴增出一條長度為865 bp的序列(GenBank登錄號：KX810817).ITS序列與已知種TrichodermavirensGv29-8的同源性高達99%，Tef 1-α序列與菌株Gv29-8的同源性高達98%.系統(tǒng)進化樹(圖6)表明，菌株TRCC27001與T.virens聚成一類，且遺傳距離最短，結(jié)合其生物學(xué)特性以及形態(tài)學(xué)特征，最終將菌株TRCC27001鑒定為綠木霉(T.virens).

A.PDA平板上的菌落形態(tài)；B.CMD平板上的菌落形態(tài)；C.CMD平板上的分生孢子堆形態(tài)；D.CMD平板上的分生孢子梗和層生瓶梗；E、F.分生孢子.圖5 TRCC27001的形態(tài)特征Fig.5 Morphological characteristics of strain TRCC27001

圖6 基于ITS序列和Tef 1-α序列以最大簡約法構(gòu)建的木霉屬系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of Trichoderma constructed by MP method based on combined ITS and Tef 1-α sequences

3 討論

目前，隨著楊樹栽植面積的不斷擴大，由金黃殼囊孢引起的楊樹腐爛病日益嚴重.發(fā)病重災(zāi)區(qū)常有林木成片死亡的現(xiàn)象，嚴重制約了林木產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[17].已有研究證明，Psuedomonasfluorcells、Bacillussubtilis、B.punilus、T.viride等均對金黃殼囊孢具有顯著拮抗效果[18].其中，木霉屬(Trichodermaspp.)真菌是常見的土壤習(xí)居菌，存在于植物殘體及動物糞便上，現(xiàn)已鑒定的種類超過100種.木霉菌的種群中有一大類被稱為拮抗木霉[19-20]，至少對18屬29種病原真菌表現(xiàn)拮抗活性[21-22].本研究中，菌株TRCC27001對12種常見病原真菌具有較強抑制效果，除楊樹炭疽菌外，相對抑菌率均在1以上.結(jié)合ITS序列和Tef 1-α序列進行分析，并根據(jù)已報道的木霉屬真菌的形態(tài)特征[13,23]，確定該菌株為綠木霉(Trichodermavirens).

木霉菌可以產(chǎn)生多達幾百種的揮發(fā)性和非揮發(fā)性抗菌次生代謝產(chǎn)物[6,24]，從而抑制甚至殺死病原菌[25].目前已知的抗菌次生代謝產(chǎn)物包括木霉素、膠霉毒素、綠木霉素、抗菌肽以及以非核糖體肽合成酶合成的Peptaibols等[26].菌株在不同的營養(yǎng)環(huán)境中會產(chǎn)生不同的有效抗菌物質(zhì)[27]，且培養(yǎng)基中纖維素的含量會影響抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生.本研究表明，以纖維素含量豐富的麩皮培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)的TRCC27001無菌發(fā)酵液，對金黃殼囊孢的抑菌活性最強，培養(yǎng)10 d后，病原菌絲生長致密，菌落邊緣增厚.麩皮為小麥加工的副產(chǎn)品，極常見且易獲取，培養(yǎng)基制作成本較低，適合大量發(fā)酵使用.另外，檢測生防木霉及其菌劑對高溫、干燥、紫外輻射的抗逆能力以及耐貯性，是其能否進行商業(yè)化應(yīng)用的重要評判標準[28].研究發(fā)現(xiàn)，菌株TRCC27001無菌發(fā)酵液具有良好的穩(wěn)定性，在pH 2～12、溫度5～105 ℃的條件下均能保持較強的抑菌活性，且對紫外線輻射不敏感.

綜上所述，菌株TRCC27001的抑菌能力強，抗逆性好，具有較大的開發(fā)應(yīng)用潛力.目前，菌株TRCC27001的其他特性尚不清楚，且其無菌發(fā)酵液中有效抑菌物質(zhì)的種類及其抑菌機制也不明確，有待進一步探索.