十字花科植物與食用菌共培養(yǎng)通過根系分泌物促進菌絲生長

薛蓉蓉, 羅智捷, 黃宇晴, 覃麗謙, 胡 林, 宋圓圓, 曾任森, 王 杰

(1.福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院/作物遺傳育種與綜合利用教育部重點實驗室;2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002)

植物的化感作用是活體植物產(chǎn)生并以揮發(fā)、淋溶、分泌和分解等方式向環(huán)境釋放次生代謝物質(zhì),而對周圍的植物產(chǎn)生有益或有害的影響, 這一自然現(xiàn)象是自然界中普遍存在的一種化學(xué)生態(tài)學(xué)現(xiàn)象[1,2].現(xiàn)已有大量研究表明[3], 化感作用對自然植物群落的形成、演替和農(nóng)作物對病草害的抗性以及連、間、套作方式有重要的影響.因此,如何使化感作用在農(nóng)業(yè)中獲得實際應(yīng)用已成為廣泛關(guān)注的問題.

根系分泌物對根際或土壤微生物的影響是化感作用研究的重要內(nèi)容之一，植物在生長期間不斷地通過根系釋放分泌物影響其周圍生物的生長[4,5].研究表明[6]，將具有不同化感潛力的分蘗洋蔥與黃瓜共培，發(fā)現(xiàn)分蘗洋蔥根系分泌物可以促進黃瓜的生長，并提高黃瓜根際土壤細(xì)菌和放線菌的數(shù)量.同樣，小麥和大豆根系浸提液可以顯著地促進黃瓜的生長，并且抑制黃瓜枯萎病菌的生長[7].

十字花科植物常被稱作為化感作物[8],越來越多的研究表明[9,10]，十字花科植物常會影響其他植物生長.在對外生菌根真菌的研究中發(fā)現(xiàn)，蘿卜的根系分泌物可以促進自然界中常見的一種外生菌根真菌土生空團菌(CenococcumgeophilumFr.)的生長[11].植物除了通過根系分泌物影響周圍生物的生長外，其揮發(fā)物也有著一定作用，例如黑芥菜和油菜的揮發(fā)物對油菜核盤菌菌絲生長有明顯的抑制作用[12].

食用菌栽培歷史悠久，食用菌產(chǎn)業(yè)也已成為我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)中僅次于糧、棉、油、果、菜的第六大產(chǎn)業(yè)[13]，菌菜間套作是近年來發(fā)展起來的高效栽培技術(shù)，通過食用菌與各種蔬菜間套作，改善生態(tài)環(huán)境，獲得菌菜雙豐收，從而提高經(jīng)濟效益[14-16].對于菌菜互作的機理，目前主要的研究集中于十字花科蔬菜冠層下的微環(huán)境對食用菌生長的影響[17]，而關(guān)于十字花科植物化感效應(yīng)對食用菌生長的影響鮮有報道.

本研究以食用菌為受體，利用芥菜為供體，研究十字花科植物化感物質(zhì)(根系分泌物和揮發(fā)物)對常見的食用菌菌絲生長的影響，為闡明菌菜共生栽培模式中化感物質(zhì)的重要作用，揭示化感物質(zhì)促進食用菌生長的生態(tài)學(xué)效應(yīng)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

芥菜[Brassicajuncea(L.) Czern. and Coss.]種子，品種為蓋山寬桿芥菜，購于福州市種子站.

常見的6種食用菌株：金針菇[Flammulinavelutiper(Fr.) Sing]、鳳尾菇(Pleurotussajur-caju)、香菇[Lentinusedodes(Berk.) Sing]、杏鮑菇[Pleurotuseryngii(DC. ex. Fr.) Quél]、黑木耳[Auriculariaauricula(L.ex Hook.) Underwood]和銀耳(TremellafuciformisBerk)均由于福建古田菌業(yè)研究院提供.

黑芥子苷(CAS:3952-98-5)，英文名稱為Sinigrin，標(biāo)準(zhǔn)純品購買于北京索萊寶科技有限公司.

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：每升含馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，pH自然.

1/2PDA培養(yǎng)基：每升含馬鈴薯100 g，葡萄糖10 g，瓊脂20 g，pH自然.

1.3 試驗方法

1.3.1 植物種子消毒 將適量種子用75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗3～5次后，用5%次氯酸鈉浸泡種子20 min，再用無菌水沖洗5次，最后用無菌水浸泡過夜預(yù)發(fā)芽.

1.3.2 食用菌和種子培養(yǎng)方法 食用菌培養(yǎng)方法： PDA培養(yǎng)基平板培養(yǎng).選擇固體菌種，用無菌打孔器在菌落邊緣截取菌種進行接種，置 25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 d.

種子培養(yǎng)方法：在無菌操作臺中將表面已消毒種子置于1/2 PDA培養(yǎng)基上，置25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.3.3 芥菜對食用菌菌絲生長的影響 (1)芥菜和食用菌共培養(yǎng)對菌絲生長的影響：在1/2 PDA平板培養(yǎng)基正中心位置接入真菌，同時以真菌為中心對稱點的三角形3個定點位置分別接入1粒已發(fā)芽的植物種子，對照處理不放種子.每個菌需要3～5個重復(fù)，置 25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察和測量菌落直徑.

(2)芥菜的揮發(fā)物對食用真菌菌絲生長的影響：將無菌的種子接入帶有分格1/2 PDA平板培養(yǎng)基內(nèi)，每個培養(yǎng)皿共4個格子，其中3個格子放入種子，置 25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，將菌種接入培養(yǎng)皿的另一格，對照為未接入植物種子的培養(yǎng)基.

(3)芥菜根系分泌物對食用菌菌絲生長的影響：將6粒無菌的植物種子接入1/2 PDA平板培養(yǎng)基中，置25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d后取出植物的幼苗.將培養(yǎng)基進行回收，121 ℃滅菌15 min，重新制作培養(yǎng)基用于接種食用菌菌株，對照為未放置種子的培養(yǎng)基.

(4)黑芥子苷對食用真菌菌絲生長的影響：分別配置含有濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0 mg·mL-1的黑芥子油苷培養(yǎng)基，對照為不添加黑芥子苷的培養(yǎng)基，滅菌后待用.以上培養(yǎng)基分別接入食用菌株，每個處理均為3次重復(fù)，放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察和測量菌落直徑.

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Minitab (Minitab Inc, State College, PA, USA)、Graphpad Prism5 (Graphpad software Inc, San Diego, CA, USA)以及Excel對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和圖表的制作.用unpaired Student′st-test分析2種處理之間的差異顯著性，用Fisher′s LSD比較法分析多重處理間的差異顯著性(P<0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 芥菜與食用菌株共培養(yǎng)對菌絲生長的影響

芥菜和食用菌共同培養(yǎng)7 d后，芥菜種子在發(fā)芽及生長的過程明顯地促進了金針菇、鳳尾菇、香菇食用菌菌絲的生長(圖1A)，但對杏鮑菇、黑木耳和銀耳3種食用菌菌絲的生長無明顯的影響(圖1B).

圖1 芥菜分別與6種食用菌共培7 d后菌絲形態(tài)Fig.1 Mycelial morphology of 6 kinds of edible fungi when co-cultured with mustard seed for 7 d

在無植物共培的情況下，6種食用菌生長速率從快到慢分別為金針菇>鳳尾菇>香菇=杏鮑菇>黑木耳=銀耳.菌絲長滿整個培養(yǎng)皿所需要的時間順序為金針菇需要11 d，鳳尾菇需要15 d， 香菇和杏鮑菇均需要17 d， 黑木耳和銀耳均需要25 d.在有植物共培的情況下，金針菇、鳳尾菇和香菇的生長周期明顯縮短，分別縮短2、2和6 d(表1～3).

表1 芥菜與金針菇共培養(yǎng)對金針菇菌絲生長的影響1)Table 1 The effects of mustard co-cultivation on the colony diameter of F.velutiper

1)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)；同行數(shù)據(jù)后附不同字母者表示數(shù)據(jù)間存在顯著差異(P<0.05)，附相同字母者表示數(shù)據(jù)間無顯著差異(P>0.05).

表2 芥菜與鳳尾菇共培養(yǎng)對鳳尾菇菌絲生長的影響1)Table 2 The effects of co-cultivation on the colony diameter of P.sajur-caju

1)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)；同行數(shù)據(jù)后附不同字母者表示數(shù)據(jù)間存在顯著差異(P<0.05)，附相同字母者表示數(shù)據(jù)間無顯著差異(P>0.05).

表3 芥菜與香菇共培養(yǎng)對香菇菌絲生長的影響1)Table 3 The effects of co-cultivation on the colony diameter of L.edodes

1)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)；同行數(shù)據(jù)后附不同字母者表示數(shù)據(jù)間存在顯著差異(P<0.05)，附相同字母者表示數(shù)據(jù)間無顯著差異(P>0.05).

此外，對于杏鮑菇而言，芥菜種子的生長對其菌絲的生長無顯著影響(表4).芥菜分別與黑木耳、銀耳共培，從第11天起，蔬菜種子生長的過程開始促進黑木耳和銀耳菌絲的生長，但從第19天開始，蔬菜種子的生長對這兩種菌株菌絲生長的影響與對照相比無明顯著差異(表5和6).

表4 芥菜與杏鮑菇共培養(yǎng)對杏鮑菇菌絲生長的影響1)Table 4 The effects of co-cultivation on the colony diameter of P.eryngii

1)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)；同行數(shù)據(jù)后附不同字母者表示數(shù)據(jù)間存在顯著差異(P<0.05)，附相同字母者表示數(shù)據(jù)間無顯著差異(P>0.05).

表5 芥菜與黑木耳共培養(yǎng)對黑木耳菌絲生長的影響1)Table 5 The effects of co-cultivation on the colony diameter of A.auricula

1)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)；同行數(shù)據(jù)后附不同字母者表示數(shù)據(jù)間存在顯著差異(P<0.05)，附相同字母者表示數(shù)據(jù)間無顯著差異(P>0.05).

表6 芥菜與銀耳共培養(yǎng)對銀耳菌絲生長的影響1)Table 6 The effects of co-cultivation on the colony diameter of T.fuciformis

1)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)；同行數(shù)據(jù)后附不同字母者表示數(shù)據(jù)間存在顯著差異(P<0.05)，附相同字母者表示數(shù)據(jù)間無顯著差異(P>0.05).

2.2 芥菜幼苗揮發(fā)物對鳳尾菇、金針菇、香菇菌絲生長的影響

通過將芥菜和食用菌分隔培養(yǎng)，驗證芥菜幼苗揮發(fā)物是否會影響食用菌生長.當(dāng)芥菜種子長出子葉后分別接入鳳尾菇、金針菇和香菇3種菌株，共培5天后，發(fā)現(xiàn)芥菜揮發(fā)物對3種食用菌菌絲的生長并無顯著影響(圖2).

圖2 芥菜揮發(fā)物處理5天后金針菇、鳳尾菇和香菇菌絲形態(tài)Fig.2 Mycelial morphology of F.velutiper, P.ajur-caju and L.edodes after treated with mustard volatiles for 5 d

2.3 芥菜幼苗根系分泌物對鳳尾菇、金針菇、香菇菌絲生長的影響

將芥菜根系分泌物添加到培養(yǎng)基中培養(yǎng)食用菌，驗證芥菜根系分泌物是否會影響食用菌的生長.結(jié)果發(fā)現(xiàn)芥菜根系分泌物明顯促進了鳳尾菇、金針菇、香菇菌絲的生長(圖3)，試驗處理7天后，在根系分泌物的影響下處理組的鳳尾菇、金針菇和香菇的菌落直徑均顯著地大于無根系分泌物處理的對照，分別約為對照菌落直徑的1.5、1.4和1.3倍(圖4).

2.4 不同濃度的黑芥子苷對鳳尾菇、金針菇、香菇菌絲生長的影響

根據(jù)2.3試驗結(jié)果，可得知芥菜根系分泌物可以促進鳳尾菇、金針菇和香菇菌絲的生長.芥菜根系分泌物中含有大量的硫苷類次生代謝產(chǎn)物，選取其中最常見的一種物質(zhì)黑芥子苷，驗證是否硫苷在芥菜促進食用菌菌絲生長中起著重要作用.金針菇菌株在含有黑芥子苷的培養(yǎng)基上生長5天，其菌落直徑明顯大于對照組；但從第6天開始，當(dāng)濃度為2和4 mg·mL-1，金針菇菌絲生長明顯受到抑制(圖5A). 黑芥子苷濃度達(dá)到2 mg·mL-1，從第3天對鳳尾菇菌絲的生長有抑制作用，當(dāng)濃度為0.5和1 mg·mL-1時，黑芥子苷對鳳尾菇菌絲的生長有促進作用(圖5B)；但是，黑芥子苷濃度達(dá)到4 mg·mL-1時，僅香菇菌絲的生長有促進的趨勢(圖5C).

圖3 芥菜根系分泌物處理7天后金針菇、鳳尾菇和香菇菌絲形態(tài)Fig.3 Mycelial morphology of F.velutiper, P.sajur-caju and L.edodes after treated with mustard root exudates for 7 d

圖4 芥菜根系分泌物處理7天后金針菇、鳳尾菇和香菇菌絲生長的影響Fig.4 The effects of mustard root exudates on colony diameters of F.velutiper, P.sajur-caju and L.edodes after 7 d

圖5 不同濃度黑芥子苷對鳳尾菇、金針菇和香菇菌絲生長的影響Fig.5 The effects of different concentrations of sinigrin on colony diameters of F.velutiper, P.sajur-caju and L.edodes

3 結(jié)論與討論

十字花科芥菜發(fā)芽及生長過程明顯促進了3種食用菌金針菇、鳳尾菇和香菇株菌絲的生長，而對其余3種食用菌生長無明顯的促生作用.為了確認(rèn)是否是芥菜揮發(fā)物起促生作用，本研究設(shè)計試驗將芥菜和食用菌用隔板隔開，排除根系分泌物的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芥菜的促生作用消失，進而證明芥菜的揮發(fā)物對食用菌菌絲生長無顯著的影響，因此可以推斷植物根系分泌物在刺激食用菌菌絲生長過程中起著關(guān)鍵作用.

芥子油苷主要存在于十字花科蔬菜當(dāng)中，在眾多的芥子油苷中，有4種常見的芥子油苷，分別是黑芥子苷、白芥子苷、葡萄糖芫菁芥素、葡萄糖異硫氰酸成-4-烯酯[18].芥子油苷分布于十字花科植物的幾乎所有部位，它的組成和含量因品種、生境而異，其在同一株植物中組成和含量也會隨著組織部分和生長階段發(fā)生變化[19,20].它以及其降解產(chǎn)物具有多種生化活性，介導(dǎo)著植物與環(huán)境之間的相互作用，從而備受關(guān)注[21,22].對于芥子油苷化感作用的研究很多，主要集中在影響其他植物種子萌發(fā)、生長方面.在種過甘藍(lán)的土壤上，豆科植物苜蓿產(chǎn)量降低，并且在土壤中放置甘藍(lán)根塊，苜蓿種子萌發(fā)也會受到明顯抑制[23].將十字花科蕓苔屬植物殘余體覆蓋于土壤表面或與土混合，可以抑制雜草種子萌發(fā)，達(dá)到控制雜草的目的[24].隨著對植物次生代謝產(chǎn)物認(rèn)識的不斷深入，發(fā)現(xiàn)蕓苔屬植物中起化感作用的物質(zhì)主要是芥子油苷及其水解產(chǎn)物[25].已有研究證實[26]，十字花科植物根系所分泌的芥子油苷的水解產(chǎn)物能夠促進菌根真菌卷傘菌和彩色豆馬勃菌絲的生長.本研究表明，黑芥子苷對食用菌菌絲的生長與其濃度有密切的關(guān)系，黑芥子苷濃度達(dá)到4 mg·mL-1時，對香菇菌絲生長有明顯的促進作用，但濃度高于2 mg·mL-1時，金針菇和鳳尾菇菌的生長會受到抑制，只有在濃度低于2 mg·mL-1時，3種食用菌的生長才表現(xiàn)出明顯加快.植物分泌部分化學(xué)物質(zhì)能夠促進真菌的生長速率，這些有效化合物被稱為“M-factor”[27].一些研究表明[28,29]，植物根系未知的分泌物在一定的濃度范圍內(nèi)可以促進土壤真菌的繁殖，因此除了考慮光照和通氣之外[30]，在進行蔬菜與食用菌共培時，還應(yīng)注意蔬菜的種植密度和布局，實現(xiàn)菌菜雙豐收.

在實際生產(chǎn)中也可將十字花科植物根系分泌物或者幼苗提取物作物促生物質(zhì)加入到培養(yǎng)基中，為食用真菌菌株的快速擴繁提供一種可行的途徑.