黃酒麥曲中一株產細菌素菌株的鑒定及其降生物胺功效研究

邢 旋，任 清

(北京工商大學 食品學院， 北京 100048)

黃酒是以糯米和黍米等谷物為原料發(fā)酵釀制而成的低酒精飲料，是我國特有的具有悠久歷史文化的酒種[1]。傳統(tǒng)的黃酒采用邊糖化邊發(fā)酵的生產工藝，開放式的半固態(tài)發(fā)酵條件導致黃酒發(fā)酵醪的微生物菌群結構異常復雜，極易產生生物胺[2-3]。黃酒中的生物胺主要是由微生物分泌的氨基酸脫羧酶催化游離氨基酸脫羧生成的一類物質，比如組胺、精胺、腐胺和尸胺等，少量生物胺為生物體內的正?；钚猿煞郑羧梭w過量攝入外源生物胺，會發(fā)生中毒反應，引起頭痛心悸呼吸紊亂，對神經(jīng)心血管系統(tǒng)造成損傷，嚴重時還會危及生命[4-7]。因此，降低生物胺含量已經(jīng)成為黃酒生產中質量控制的重要目標。

目前，黃酒生產通常采用改進生產工藝來控制生物胺，例如采用乳酸菌的生物酸化浸米技術、調整貯藏溫度和控制游離氨基酸含量等技術[8-10]。這些技術雖然一定程度上降低了生物胺含量，但是，仍然不能滿足黃酒質量安全的需求。近年來，隨著黃酒微生物研究的深入，篩選利用不產生物胺菌株，特別是高產細菌素的菌株釀造黃酒，將會是黃酒生產中控制生物胺含量的有效途徑。

細菌素是由某些細菌產生的一類具有抗菌活性的蛋白質或肽類物質[11]，因其易被人體胃腸道中的蛋白酶降解，具有安全、無毒、抗菌等特點，因此，細菌素被認為最有前途的食品防腐劑[12-13]。黃酒發(fā)酵過程中，運用產細菌素的菌株，抑制產生物胺菌的生長，可能是降低黃酒中生物胺含量的有效途徑。本實驗從黃酒酒曲中發(fā)現(xiàn)一株產細菌素菌株，篩選鑒定并對其降生物胺功效研究，以期為降低黃酒中生物胺含量提供理論依據(jù)和有價值的微生物。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1實驗材料與培養(yǎng)基

黃酒麥曲，北宗黃酒有限公司提供；菌株M28，由實驗室自制黃酒麥曲中分離；腐生葡萄球菌，阪崎腸桿菌，乳酪短桿菌，芽孢桿菌，陰溝腸桿菌，均為實驗室黃酒發(fā)酵過程中分離出來的雜菌；通用引物(27f和1492r)，生工生物工程(上海)股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、2xPfu PCR MasterMix，天根生化試劑公司。

TPY瓊脂培養(yǎng)基的制備：水解酪蛋白10.0 g、大豆胨5.0 g、酵母粉2.0 g、葡萄糖5.0 g、L-半胱氨酸0.5 g、K2HPO42.0 g、MgCl20.5 g、ZnSO40.25 g、CaCl20.15 g、FeCl31×10-6g、瓊脂20.0 g。pH值(6.5±0.1)，25 ℃，加蒸餾水定容至1 L，加熱煮沸溶解，121 ℃高壓滅菌20 min。

MRS培養(yǎng)基的制備：蛋白胨10.0 g、葡萄糖20.0 g、CH3COONa 5.0 g、MgSO40.2 g、MnSO40.05 g、瓊脂粉15.0 g、牛肉粉5.0 g、酵母粉4.0 g、K2HPO42.0 g、檸檬酸三胺2.0 g、Tween 80 1 mL，加蒸餾水定容至1 L，加熱煮沸溶解，121 ℃高壓滅菌20 min。其液體培養(yǎng)基配制時不加瓊脂粉。

液體脫羧酶檢測顯色培養(yǎng)基的制備：胰蛋白胨5 g、酵母膏5 g、牛肉膏5 g、 NaCl 2.5 g、葡萄糖0.5 g、Tween 80 1 mL、 MgSO40.2 g、 MnSO40.05 g、FeSO40.04 g、檸檬酸銨2 g、 K2HPO42 g 、CaCO30.1 g、磷酸吡多醛0.05 g、溴甲酚紫0.06 g、放線菌酮0.05 g。分別添加賴氨酸5.0 g、鳥氨酸鹽酸鹽5.0 g、L-組氨酸鹽酸鹽2.0 g、酪氨酸1.0 g、苯丙氨酸2.0 g，配成5種培養(yǎng)基，用于檢測尸胺、腐胺、組胺、酪胺、苯乙胺。調pH值至5.3，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

固體脫羧酶檢測顯色培養(yǎng)基的制備(g/L)：瓊脂粉18.0，其他成分同液體脫羧酶培養(yǎng)基，pH值為5.3，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

LB培養(yǎng)基的制備：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、瓊脂粉15 g，加蒸餾水至1 000 mL, 用5 mol/L NaOH(約0.2 mL)調pH=7.2，121 ℃滅菌30 min。

1.1.2主要實驗設備

XP型基因擴增儀，杭州博日科技有限公司；Imager 2200型凝膠成像系統(tǒng)，美國Alpha公司。

1.2 實驗方法

1.2.1菌株M28產細菌素特性驗證分析

1.2.1.1 牛津杯抑菌實驗

采用牛津杯法分析菌株M28抑菌效果，指示菌株為腐生葡萄球菌、短酪乳桿菌、地衣芽孢桿菌、短小桿菌、解淀粉芽孢桿菌、可可鏈霉菌、枯草芽孢桿菌、木糖氧化無糖桿菌、歐文氏桿菌、沙福芽孢桿菌、芽孢桿菌、阪崎腸桿菌、陰溝腸桿菌，指示菌株均由黃酒麥曲篩選鑒定所得。

在滅菌的培養(yǎng)皿中注入約25 mL LB培養(yǎng)基，均勻鋪滿培養(yǎng)皿底部，待LB培養(yǎng)基凝固后，取100 μL指示菌菌懸液加入LB固體培養(yǎng)基中，均勻涂布于平板上，在表面等間距放置滅菌的牛津杯。接著將100 μL M28發(fā)酵液注入到小孔內，4 ℃下擴散3～5 h，然后將培養(yǎng)皿置于37 ℃培養(yǎng)24～36 h，用尺子測定抑菌圈的直徑。

將M28菌株接種于裝有10 mL MRS液體培養(yǎng)基37 ℃下培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液經(jīng)1×104r/min離心10 min取得上清液，牛津杯法測定發(fā)酵上清液的抑菌活性。

1.2.1.2 排除有機酸的干擾實驗

發(fā)酵上清液對指示菌的抑制作用可能是細菌素也可能是酸性物質如乳酸等有機酸作用的結果, 為排除酸的干擾,將1.2×104r/min離心10 min的上清液用2.5 mol/L的NaOH溶液中和至pH值為6.5～7.0，通過牛津杯雙層平板法進行抑菌試驗，向牛津杯中加入中和前后的發(fā)酵上清液100 mL，并在水平條件下將平板放于4 ℃冰箱中擴散5 h,置于37 ℃下培養(yǎng)24 h，分別檢測兩者的抑菌活性，比較中和酸前后抑菌圈的差異，每次實驗3次重復。

1.2.1.3 過氧化氫作用的檢測與排除

將過氧化氫酶溶解于50 mml/L的磷酸緩沖液(pH=7.0)中配成母液，加入到經(jīng)酸排除的實驗菌株上清液中，使過氧化氫酶的最終濃度達到5 mg/mL，37 ℃水浴2 h后取出，檢測過氧化氫酶處理后上清液的抑菌活性，取3次平行實驗求均值。

1.2.1.4 蛋白酶敏感實驗

將蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶分別溶解在50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH=7.6)中配成母液，加實驗菌株到發(fā)酵上清液中，使其終濃度為1 mg/mL，調節(jié)pH值至各酶的最適作用范圍，37 ℃水浴2 h后取出。再將pH值調回至6.5～7.0，并用緩沖液稀釋相同倍數(shù)的發(fā)酵上清液作為對照，檢測各種蛋白酶對發(fā)酵上清液抑菌活性的影響。

1.2.2菌株M28生物學鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學特征觀察

挑取菌株劃線接種于相應的固體MRS培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察并記錄其菌落形態(tài)特征，挑取單菌落進行涂片，革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察并記錄其大小、顏色、形狀排列等。

1.2.2.2 菌種的16S rDNA的鑒定

挑取平板上的菌落，使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA作為PCR的模板。采用通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增細菌的16S rDNA序列。反應體系(25 μL)為12.5 μL 2xPfu PCR MasterMix、7.5 μL dd H2O、23 μL DNA模板、1 μL 27f (1 0 μmol / L )、 1 μL 1492r(10 μmol/L)。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；然后72 ℃延伸5 min，4 ℃暫時保存，-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。? μL的PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳檢測后的PCR產物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成純化和測序，獲得16S rDNA基因序列。測序結果在NCBI的Genebank 中進行 BLAST 分析比對，進行同源序列搜索，根據(jù)搜索結果，確定菌株的種屬。

1.2.3脫羧酶培養(yǎng)基顯色反應

取活化后的M28菌液0.2 mL于固體脫羧酶培養(yǎng)基上進行涂布，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，觀察顏色變化，黃色為陰性，紅色或紫色為陽性。

1.2.4生物胺含量的高效液相色譜檢測

將黍米淘洗干凈并浸泡24 h，加入2.5倍質量的去離子水煮熟，加入ω=0.1%糖化酶糖化60 min，隨后加入φ=15%的黃酒麥曲，同時加入φ=0.1%經(jīng)活化的M28菌液(10 mol/L)拌勻，裝入黃酒發(fā)酵罐中28 ℃下發(fā)酵10 d，然后于20～25 ℃后酵室發(fā)酵50 d，然后經(jīng)榨酒和煎酒至成品黃酒。以不添加M28菌液釀制的黃酒為對照。采用GB 5009.208—2016《食品中生物胺的測定》檢測其生物胺含量[14]。

1.2.5黃酒中揮發(fā)性物質的GC-MS分析

黃酒發(fā)酵同1.2.4節(jié)，GC- MS技術分析檢測黃酒中揮發(fā)性物質。

樣品處理：采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS的萃取頭對黃酒樣品中的揮發(fā)性成分進行萃取。在15 mL的頂空瓶中加入8 mL黃酒樣品，2.5 g NaCl，插入萃取頭，于50 ℃吸附萃取45 min，230 ℃條件下解吸附5 min，用于GC- MS的數(shù)據(jù)采集分析。

氣相色譜條件：進樣溫度230 ℃，載氣He，分流進樣，分流比50∶1，流速1 mL/min。色譜柱型號為DB- WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，初始柱溫為35 ℃，保持4 min，以5 ℃/min的速率升溫，最終溫度為150 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 的速度升溫至210 ℃。

質譜條件：EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，掃描范圍30.00～350.00 u。

定量方法：以2-辛醇為內標的半定量法。

1.2.6氨基酸態(tài)氮、酒精度和pH值分析檢測

采用GB/T 13662—2018《黃酒》分析檢測黃酒氨基酸態(tài)氮、酒精度和pH值[15]。

2 結果與分析

2.1 菌株M28產細菌素特性驗證分析

菌株M28由實驗室自制黃酒麥曲中分離，腐生葡萄球菌，阪崎腸桿菌，乳酪短桿菌，芽孢桿菌，陰溝腸桿菌，均為實驗室黃酒發(fā)酵過程中分離出來的雜菌，也是北方黃酒發(fā)酵常見的污染菌。

采用牛津杯法分析菌株M28抑菌效果見圖1、圖2和表1，菌株M28對分離出來的13種雜菌的5種具有明顯的抑制作用，其無菌發(fā)酵液也具有相同的抑菌特性，說明菌株M28能夠產生抑菌物質，對腐生葡萄球菌、阪崎腸桿菌、乳酪短桿菌、芽孢桿菌和陰溝腸桿菌均具有抑制效果。

N28、M29、N18、J22和J18均為實驗室分離出來尚未鑒定的菌株，沒有抑菌特性圖1 菌株M28抑菌實驗Fig.1 Antibacterial experiment of strain M28

圖2 M28發(fā)酵上清液抑菌活性Fig.2 Antimicrobial activity of strain M28 fermentation supernatant

排除有機酸和過氧化氫實驗結果表明，抑菌特性可能是因為M28產生了抑菌物質，經(jīng)蛋白酶K和胰蛋白酶降解后，失去了抑菌活性，說明該物質為蛋白質或多肽，為細菌素類物質，該細菌素具有較廣譜的抑菌活性，而且對蛋白酶K和胰蛋白酶敏感，但是，對胃蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶的酶敏感性較弱。

2.2 菌株M28生物學鑒定

M28菌落形態(tài)為圓形，表面光滑，凸起，不透明，淺黃色，邊緣整齊，光學顯微鏡下觀察，革蘭氏染色陽性，球狀或短棒狀，無芽孢(見圖3)。對M28菌株進行16S rDNA分析(見圖4)，將PCR擴增產物送交測序公司進行測序，返回序列進行比對分析，通過進化樹分析(見圖5)，證明M28為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。

表1 M28細菌素鑒定實驗

“+”表示反應陽性，“-”表示反應陰性。

視圖為10×100倍。圖3 M28菌體形態(tài)圖Fig.3 Characteristic of M28 cells

圖4 M28菌株16S rDNA的電泳檢測圖Fig.4 Electrophoretic detection of 16S rDNA of strain M28

圖5 基于16S rDNA序列構建的進化樹Fig.5 Phylogenetic trees based on 16S rDNA sequences

2.3 菌株M28對黃酒生物胺的影響

脫羧酶培養(yǎng)基顯色反應實驗中，培養(yǎng)初期，細菌繁殖，利用葡萄糖產酸使培養(yǎng)液pH值下降，溴甲酚紫指示劑變黃色，繼續(xù)培養(yǎng)，若細菌產氨基酸脫羧酶，則氨基酸在脫羧酶的作用下發(fā)生脫羧反應生成胺和二氧化碳，pH值上升呈堿性，使含指示劑的培養(yǎng)基由黃色變?yōu)樽仙?，由此，可通過培養(yǎng)基顏色變化判斷細菌是否產生物胺。

脫羧酶培養(yǎng)基顯色反應結果如表2所示，培養(yǎng)腐生葡萄球菌和阪崎腸桿菌，能夠產腐胺、酪胺、尸胺、組胺和苯乙胺5種常見的生物胺；乳酪短桿菌產腐胺、酪胺、尸胺和組胺4種生物胺；芽孢桿菌產酪胺、尸胺、組胺和苯乙胺4種生物胺；陰溝腸桿菌產腐胺、酪胺、尸胺和苯乙胺4種生物胺。但是，菌株M28培養(yǎng)過程中沒有檢測到生物胺的產生，說明菌株M28自身不產生物胺。

表2 生物胺顯色反應實驗

“+”表示反應陽性，“-”表示反應陰性。

黃酒發(fā)酵過程中添加強化M28菌株，應用HPLC檢測黃酒中的生物胺含量，實驗結果如圖6。添加強化M28菌株釀造的黃酒與對照未添加的相比，生物胺含量明顯降低，其中，添加M28菌株釀造的黃酒未檢出酪胺和尸胺，腐胺、組胺和苯乙胺含量顯著降低，腐胺含量降低最顯著達52%，表明添加強化M28菌株可以顯著降低黃酒中的生物胺的含量，提高黃酒品質，可能是因為M28菌株可以產生細菌素，有效抑制了一些產生物胺雜菌的生長繁殖，而M28菌株本生不產生物胺，因此，黃酒發(fā)酵過程中添加強化M28菌株，可以顯著降低黃酒中的生物胺含量。

圖6 2種黃酒中生物胺的含量Fig.6 Biogenic amines contents in two kinds of Huangjiu

2.4 菌株M28對黃酒風味品質的影響

黃酒發(fā)酵過程中添加強化M28菌株，應用GC- MS檢測黃酒中的揮發(fā)性物質，實驗結果見表3和表4。添加強化M28菌株釀造的黃酒中檢測出烷烴類、醇類、酯類、酮類、醛類、酸類、吡嗪類、酚類和其他揮發(fā)性物質共107種，未添加M28菌株釀造的黃酒中，共檢測出揮發(fā)性物質105種，而且揮發(fā)性風味物質的含量也沒有顯著差異。表明黃酒發(fā)酵過程中，添加強化M28菌株對黃酒的香味品質基本沒有影響。

黃酒發(fā)酵過程中添加強化M28菌株，分析檢測黃酒中的氨基酸態(tài)氮、酒精度和pH值，實驗結果見表5。添加強化M28菌株釀造的黃酒與對照黃酒相比，酒精度沒有明顯變化，氨基酸態(tài)氮含量顯著提高，pH值顯著降低。分析原因，可能因為添加M28菌株，有效抑制了一些產生物胺雜菌的生長繁殖，氨基酸轉化合成生物胺減少，氨基酸積累增多，因此，氨基酸態(tài)氮含量提高，酸度降低。

表3 2種黃酒中揮發(fā)性物質的種類

表4 2種黃酒中揮發(fā)性物質的含量

表5 2種黃酒中氨基酸態(tài)氮、酒精度和pH值

3 討論與結論

菌株M28由實驗室自制黃酒麥曲中分離，腐生葡萄球菌、阪崎腸桿菌、乳酪短桿菌、芽孢桿菌和陰溝腸桿菌，均為實驗室黃酒發(fā)酵過程中分離出來的雜菌，也是制曲過程中或者發(fā)酵過程中常見的污染雜菌。M28經(jīng)鑒定為戊糖片球菌，該片球菌能夠產生細菌素，對黃酒中產生物胺的腐生葡萄球菌、阪崎腸桿菌、乳酪短桿菌、芽孢桿菌和陰溝腸桿菌均具有抑制作用。

菌株M28自身發(fā)酵不產生物胺，黃酒發(fā)酵過程中，添加強化M28菌株，黃酒的品質發(fā)生了變化，一方面，添加強化M28菌株，香味物質和酒精度沒有明顯變化，但是，生物胺含量顯著降低，氨基酸態(tài)氮含量顯著提高，提高和改善了黃酒品質；另一方面，添加強化M28菌株，pH值降低，即酸度提高了，可能會影響原來的口感。如果結合生產工藝的改進和延長窖藏時間，可能會降低酸度。總之，M28作為一株可以降低黃酒中的生物胺含量的功能性菌株，隨著研究的深入，將會在黃酒釀造和品質改良中發(fā)揮重要的作用。