中國黏膜黑色素瘤的臨床特點及基因突變分析

黃復(fù)雪，李丹丹，文習(xí)之，李婧婧，祝保艷，張曉實

（中山大學(xué)腫瘤防治中心生物治療科，廣東廣州510060）

黑色素瘤是一種具有高度侵襲性和種族特異性的惡性腫瘤。在中國每年新發(fā)病人數(shù)超過2萬［1］。與西方人不同，中國黑色素瘤人群以肢端及黏膜型為主，黏膜型發(fā)病率約為24%［2］，明顯高于西方的1.3%，且具有發(fā)現(xiàn)晚，預(yù)后差的特點（中位生存時間，黏膜型9.1個月vs.皮膚型11.7個月）［3］。近年來，免疫治療及靶向治療在黑色素瘤治療方面發(fā)展迅速，但可獲益患者占比少，且黏膜型黑色素瘤免疫治療療效較皮膚型黑色素瘤差［4］，可供選擇靶向治療藥物有限。新的治療方法有賴于對腫瘤分子機制的不斷深入探索，本研究擬通過聯(lián)合中國黏膜黑色素瘤患者的二代測序（next generation sequencing，NGS）測序結(jié)果及臨床資料，為探尋中國黏膜黑色素瘤患者的個體化治療提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2017年9月至2018年9月在中山大學(xué)腫瘤防治中心生物治療科就診并在我院行NGS測序的25例黏膜型黑色素瘤患者的臨床資料及基因檢測結(jié)果。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織樣本采集和DNA提取 基因組DNA按照QIAamp DNA FFPE Tissue Kit說明書提取，DNA濃度使用Qubit dsDNA assay（Life Technologies）進行測定。

1.2.2 NGS文庫制備 使用Covaris M220超聲儀行DNA片段化，隨后行末端補平、磷酸化和接頭連接。使用Agencourt AMPure beads（Beckman Coulter，Brea，CA，USA）回收200～400 bp的DNA片段，隨后行捕捉探針（釣餌）雜交，捕獲雜交片段和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增。采用生物分析儀進行高靈敏度DNA檢測以評估片段的質(zhì)量和大小。50ng DNA用于文庫構(gòu)建。12個PCR循環(huán)用于文庫擴增。富集的雙端測序（讀取長度150 bp）的樣品在Nextseq500測序儀（Illumina，Inc，San Diego，CA，USA）上進行測序。

1.2.3 Panel描述 包含295個與癌癥發(fā)生機理及靶向治療密切相關(guān)的基因，利用探針雜交法富集其中287個基因的外顯子區(qū)域和22個基因的內(nèi)含子區(qū)域，報告與癌癥有明確臨床相關(guān)性的基因突變、擴增及融合變異（圖1）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以樣本的絕對數(shù)和相應(yīng)的百分比表示。

2 結(jié)果

2.1 患者基本信息

研究共納入黏膜黑色素瘤患者25例，其中男性14例（56%），女性11例（44%）。中位年齡為57歲，各亞型比例為：頭頸黏膜13例（52%），陰道及尿道6例（24%），直腸肛管2例（8%），食管4例（16%），見表1。

圖1 295個基因列表Fig.1 The 295 genes in our panel

表1 病人臨床病理特點Table 1 Clinicopathological characteristics of the patients

2.2 黏膜黑色素瘤患者主要驅(qū)動基因突變情況

在25例黏膜黑色素瘤患者中，BRAF基因共觀察到5例突變（5/25，20%），均發(fā)生在頭頸黏膜黑色素瘤患者，其他類型黏膜黑色素瘤患者未見突變，其中2例為p.V600E突變，1例p.D94G突變，1例KCTD15-BRAF基因融合和1例基因拷貝數(shù)增加。KIT基因突變共在5（20%，5/25）例患者中檢測到，3例拷貝數(shù)增加，2例錯義突變，突變位點分別為p.W557G和p.L576P。3（12%，3/25）例患者檢測到NRAS基因突變，位點分別為p.Q61R，p.G12V和p.G12D，均為熱點突變。NF1基因突變共在2（8%，2/25）例患者中檢測到3個變異，其中一例患者為p.Ala399fs移碼突變，1例患者為p.Ser1331fs移碼突變和p.K2593M錯義突變，黑色素瘤驅(qū)動基因BRAF，NRAS，KIT，NF1的分布見圖2。

2.3 黏膜黑色素瘤患者基因突變頻率及各不同通路的突變情況

295個基因中125個基因發(fā)生至少一個變異，變異類型包括錯義突變，剪切突變，拷貝數(shù)增加及缺失，無義突變，基因重排和基因融合。變異最多的基因為MYC基因，共觀察到9例（9/25，36%），均表現(xiàn)為基因拷貝數(shù)增加（CN=2.67-6.74）。其次發(fā)生變異的基因為KDR，突變率為24%（6/25），除1例病人KDR同時觀察到基因錯義突變和拷貝數(shù)增加，其余患者均表現(xiàn)為基因拷貝數(shù)增加。目前，這些基因在黏膜黑色素瘤高頻突變尚未見報道。多靶點藥物治療靶點如MET，PDGFRA，F(xiàn)LT4，ROS1等，及其他靶向治療靶點如ALK，EGFR，ERBB3，mTOR等均在黏膜黑色素瘤患者有觀察到。具體基因突變類型及分布見圖3。

圖2 25例黏膜黑色素瘤患者BRAF，NRAS，NF1及KIT基因突變分布Fig.2 Mutations of BRAF，NRAS，NF1，and KIT in 25 mucosal melanoma patients

隨后，我們將125個基因根據(jù)功能分為DNA損傷修復(fù)、MAPK、生長因子及其受體、細(xì)胞周期、PI3K-mTOR、免疫應(yīng)答和WNT/NOTCH相關(guān)通路，未納入相關(guān)通路的基因沒有納入本部分分析。變異率最高的通路為DNA損傷修復(fù)76%（19/25），隨后依次為細(xì)胞周期72%（18/25），生長因子及其受體 60%（15/25），PI3K-mTOR56%（14/25），MAPK 36%（9/25），免疫應(yīng)答 28%（7/25）和WNT/NOTCH相關(guān)通路24%（6/25）。在DNA損傷修復(fù)相關(guān)通路，我們可觀察到多個同源重組修復(fù)相關(guān)基因突變，如NBN，BLM，BRCA2，BRIP1，SMARCD1。細(xì)胞周期相關(guān)通路中，包含多個與黑色素瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因，如CCND1，CDK4，SOX10等。生長因子受體通路包含多個超進展相關(guān)基因，如FGF19，F(xiàn)GF3和FGF4據(jù)報道可能與免疫治療后超進展現(xiàn)象的發(fā)生有關(guān)。MAPK通路變異主要表現(xiàn)在BRAF，NF1及NRAS熱點基因突變。各個通路包含的基因及分布見圖4。

2.4 黏膜黑色素瘤患者的腫瘤突變負(fù)荷（Tumor mutation burden，TMB）及免疫相關(guān)基因突變情況

圖3 125個突變基因突變頻率Fig.3 Mutation frequency of 125 mutated genes

在25例黏膜黑色素瘤患者中，中位TMB為6.12（2.04～10）/Mb（圖5）。免疫應(yīng)答通路突變率為28%（7/25），我們觀察到了與免疫治療相關(guān)的JAK1/2，HLA-A基因的變異，突變頻率分別為8%（2/25）和4%（1/25）。其他基因如BCR，CARD11，JAK3及STAT4也觀察到4%（1/25）的突變（圖4）。

圖5 25例黏膜黑色素瘤病人的腫瘤突變負(fù)荷Fig.5 TMB of our 25 mucosal melanoma patients

3 討論

黏膜黑色素瘤整體發(fā)病率低，侵襲性強，發(fā)展到晚期缺乏有效的治療選擇，深入了解其基因突變譜，探索新的治療方法迫在眉睫。我們首次運用NGS對中國黏膜黑色素瘤人群的基因突變譜進行了探索，并發(fā)現(xiàn)多個目前在中國黏膜黑色素瘤人群尚未見報道的基因突變。

首先，我們觀察了25例黏膜黑色素瘤患者中黑色素瘤的主要驅(qū)動基因變異，并與西方黏膜黑色素瘤測序結(jié)果及我中心皮膚黑色素瘤數(shù)據(jù)進行對比。不同于西方人群測序結(jié)果，在我們的黏膜黑色素瘤病人中，BRAF突變頻率較高，為20%（5/25），且突變率高于我中心總的黑色素瘤人群（20%vs.16.3%），但低于皮膚黑色素瘤人群（20%vs.27%）［5］，且均集中在頭頸黏膜，其中 2例為p.V600E突變，1例p.D94G突變，1例KCTD15-BRAF基因融合和1例基因拷貝數(shù)增加。BRAF-V600抑制劑可為p.V600E突變提供治療選擇，對于非BRAF-V600突變患者，已有研究表明FDA已批準(zhǔn)的BRAF-V600抑制劑，如vemurafenib及dabrafenib對非BRAF-V600突變的患者無效，而其他BRAF抑制劑的有效性尚未可知，有待大規(guī)模臨床試驗進一步證實，廣譜RAF抑制劑及MEK抑制劑可能會發(fā)揮療效，也有待進一步證實［6-7］。KIT基因突變率為20%（5/25），NF1基因突變頻率為12%（3/25），均低于Hintzsche報道的西方人群的48%及37%，且各黏膜類型突變頻率均低于Hintzsche［8］的報道，但KIT基因突變頻率高于我們之前報道的總突變率5.8%，及皮膚型黑色素瘤的3%，也證實在中國黏膜黑色素瘤患者中，KIT或也屬于主要驅(qū)動基因。NRAS基因突變頻率為12%（3/25），位點分別為p.Q61R，p.G12V和p.G12D，均為熱點突變，也高于我們此前報道的皮膚的7%，與總的10.5%類似［5］。

隨后，我們對黏膜黑色素瘤中各信號通路及基因的變化進行了觀察。在我們的研究中，最常見的基因突變?yōu)镸YC基因擴增，其次為KDR擴增。MYC基因家族及其產(chǎn)物可促進細(xì)胞增殖，永生化，去分化和轉(zhuǎn)化等，在多種腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用。已有體外實驗證實c-MYC基因高表達(dá)與皮膚黑色素瘤侵襲性呈正相關(guān)，MYC抑制劑JQ1可有效抑制腫瘤生長［9］，并有報道表明MYC或可調(diào)控PD-L1表達(dá)，影響免疫治療療效［10］。盡管MYC在黏膜黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚待研究，在存在有效抑制劑的情況下，MYC或可為黏膜黑色素瘤的治療提供新的治療靶點。KDR（VEGFR-2）是VEGF發(fā)揮促血管生成作用的主要功能性受體，具有明顯趨化性和促分裂活性，是血管形成的主要調(diào)控因子，在維持腫瘤細(xì)胞生長過程中發(fā)揮重要作用［11］。

在各信號相關(guān)通路變異中，DNA損傷修復(fù)通路變異率最高，為76%（19/25）。既往我們認(rèn)為黏膜黑色素瘤發(fā)生部位隱匿，無日光損傷，此通路變異率低，然而我們的數(shù)據(jù)表明，在黏膜黑色素瘤病人中廣泛存在DNA損傷修復(fù)通路變異，或許與慢性炎癥介導(dǎo)的DNA損傷有關(guān)。PARP抑制劑被認(rèn)為是BRCA胚系突變的有效治療藥物，在乳腺癌，卵巢癌及前列腺癌的治療上發(fā)揮重要作用，最近有報道顯示在非BRCA突變的腫瘤中，PARP抑制劑同樣可以發(fā)揮作用，存在ATM，ATRX，EMSY，F(xiàn)ANCI，RAD52等其他DNA損傷修復(fù)相關(guān)通路突變的腫瘤或也可獲益于PARP抑制劑［12-14］。對于合并細(xì)胞周期及PI3K-mTOR相關(guān)通路變異的黑色素瘤，有學(xué)者此前在體內(nèi)及體外實驗中均證實CDK4/6抑制劑及PI3K-mTOR通路抑制劑可發(fā)揮療效［15-16］。生長因子受體通路上我們可見多個散發(fā)有可選靶向藥物治療的靶點，如MET，PDGFRA，KDR，F(xiàn)LT4，ALK，ERBB3及ROS1等。免疫應(yīng)答相關(guān)通路中的基因突變，如JAK1/2，可能與免疫治療繼發(fā)耐藥相關(guān)，對于合并此類基因突變的患者，聯(lián)合治療或許可以使患者獲益［17］。

綜上所述，在我們25例行NGS測序的黏膜黑色素瘤患者中，最常見的基因突變?yōu)镸YC，KDR等基因擴增，DNA損傷修復(fù)，細(xì)胞周期，PI3K-mTOR及生長因子受體通路廣泛存在突變，且存在多個藥物治療靶點。黏膜黑色素瘤基因突變與其他類型黑色素瘤存在差異，NGS測序可為黏膜黑色素瘤的治療提供潛在治療靶點。