運(yùn)用有效的預(yù)處理方式改進(jìn)菊科植物染色體標(biāo)本制備技術(shù)

張楠卿

據(jù)了解， 菊科植物約1000屬，25000-30000種，廣布全世界，熱帶較少。我國約233屬，近3000種。本科植物花兩性或單性，稀單性異株，整齊或左右對稱。種子無胚乳，具2、稀1枚子葉。本科種類繁多，許多種類富有經(jīng)濟(jì)價(jià)值，良好的藥用價(jià)值，菊科的一個(gè)主要特征是菊糖完全代替了淀粉作為多聚糖貯存。菊科所含有的倍半萜內(nèi)酯類具有強(qiáng)心、抗癌、驅(qū)蟲、鎮(zhèn)痛等作用。本科中有350余種倍半萜內(nèi)酯。地膽草屬某些種含苦地膽苦素和異苦地膽苦素。這些成分均有抑制腫瘤生長的作用。值得我們?nèi)パ芯俊?/p>

此次選取菊科植物中的百日草為例子。

首先是材料的處理過程：

1.前處理 活體根系的處理，發(fā)芽材料的根系在不同的處理液中浸泡，此處選取秋水仙素濃度0.01%于8-16℃處理10-24小時(shí)，了解到，低溫處理有利于染色體縮短和獲得多的中期分裂相。

2.固定? ?將前處理材料取出，進(jìn)行自來水清晰，再用固定液進(jìn)行處理24小時(shí)，植物材料的固定可用酒精和醋酸混液作固定劑。卡諾或FAA等真空材料使其快速滲透（針筒抽氣直到材料下沉）。一般組織切片使用FAA固定液。

3.材料保存 所用材料經(jīng)過固定，必須經(jīng)過清洗。用水配置的固定液多用水洗，用酒精配置的多用濃度相同或者稍低濃度的酒精洗滌，后置于FAA液體中保存。

4.離析壓片 細(xì)胞離析觀察，可用1N的鹽酸（10%）在60℃的水浴處理五分鐘到十五分鐘，我們實(shí)驗(yàn)中處理了大約十分鐘，如果時(shí)間過長，不易染色，時(shí)間不足的話細(xì)胞不易分開。離析后用水沖洗鹽酸直到干凈，后使用染色劑染色。

染色體的壓片，將洗凈的根尖放于培養(yǎng)皿中，加入染劑染色（卡寶品紅）幾小時(shí)，將根尖放在載玻片上，滴一滴45%醋酸溶液，迅速搗碎根尖，蓋上玻片，進(jìn)行擠壓，用橡皮頭輕輕搗，并且用火輕烤。

5.鏡檢 壓片后進(jìn)行鏡檢，把符合的玻片裝置進(jìn)行標(biāo)記，并且在冰箱之中凍結(jié)，取下蓋玻片，采用50%酒精—70%酒精—95%酒精—無水酒精+二甲苯，封片。

植物制片中的染色類型：

（1） 番紅-圓綠對染法

葉組織切片最常用的染色方法，染色結(jié)果是染成紅色，薄而具纖管地物的限方真纖增素的細(xì)胞壁及細(xì)質(zhì)染成綠色。

2） 鐵礬蘇木精法? 細(xì)胞質(zhì)染成淺灰色或植物細(xì)胞學(xué)及胚胎學(xué)制片上應(yīng)用細(xì)胞分裂時(shí)期的染色體染成監(jiān)果色，要染色效果在4-6無色。用0.59%蘇木精水溶液。木精粉末在水中完全解約需1周左右1周達(dá)到最好：放3-6 個(gè)月后實(shí)效。

細(xì)胞分裂制片的染色。材料最好用銀酸

（3）? 番紅-結(jié)晶紫-橘紅G三重染色酸和鉻酸固定。

染色體染成紅色、染色質(zhì)紫色、核仁淡紅色、紡錘絲紫色、細(xì)胞質(zhì)淡黃灰色。

4） 鞣酸-三氧化鐵法

植物分生組織-生長性制片。薄壁組織的細(xì)胞壁染成黑色或深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)灰色，細(xì)胞核紅色

（5）高碘酸-席夫（PAS） 反應(yīng)法

高等植物纖維素細(xì)胞壁及淀粉粒的染色?？蓪⒗w維素細(xì)胞壁及儲(chǔ)藏淀粉染色鮮紅色。

染色體制片按Song的方法。當(dāng)生長旺盛的供試材料根長23cm時(shí)，取2mm長的根尖放入飽和a-澳蔡溶液25"C處理4hr，去離子水充分洗凈后用新鮮甲醇和冰乙酸混合液（3： 1）

固定3-24hr，水洗后置2%纖維素酶（Sigma）和2%果膠酶（SERVA） 溶液中，28°C條件

下酶解約1.5hr. 水洗并固定后采用火焰干燥法制片，-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

（6）染料的配方：醋酸-洋紅法

配制： SOml的45%醋酸水溶液在錐形瓶中煮沸，徐徐投入0.5g洋紅粉末。煮1-2min放一鐵釘Imin，或加入醋酸鐵溶液1-2滴，過濾后保存于棕色瓶中。

植物染色體組的觀察：

（1）取材 觀察有絲分裂材料：材料可用根尖，莖端等等，種子萌發(fā)的根尖長約1-2mm合適，種子大的可以取側(cè)根，栽培植物的根尖則應(yīng)取新的萌發(fā)幼根。

觀察減數(shù)分裂材料選擇幼小花芽，取材時(shí)間應(yīng)進(jìn)行不同時(shí)間階段的處理，間隔一個(gè)半小時(shí)左右，根尖取三厘左右，莖或花蕾進(jìn)行材料切割，分成3—4mm大小塊組織。

（2）預(yù)處理 植物進(jìn)行有絲分裂時(shí)，染色體形狀細(xì)長，交織在一起不利于觀察，需要進(jìn)行前處理，目的在于阻礙紡錘絲的形成，促使染色體收縮變短。

首先，用100ml蒸餾水加入一滴a-溴萘，充分振蕩，配成飽和水溶液。

其次，100ml的對二氯苯飽和溶液中加入一滴a-溴萘，充分振蕩，大染色體材料處理2—12hr，真空處理使其快速滲透。

（3）固定? ?植物材料的固定可以用酒精和醋酸混液作固定劑，進(jìn)行真空處理使其快速滲透，一般組織切片用FAA作固定液。

（4）離析壓片 細(xì)胞離析觀察，可用1N的鹽酸（10%）在60℃的水浴處理五分鐘到十五分鐘，我們實(shí)驗(yàn)中處理了大約十分鐘，如果時(shí)間過長，不易染色，時(shí)間不足的話細(xì)胞不易分開。離析后鼻音用水沖洗鹽酸直到干凈，后使用染色劑染色。

染色體的壓片，將洗凈的根尖放于培養(yǎng)皿中，加入染劑染色（卡寶品紅）幾小時(shí)，將根尖放在載玻片上，滴一滴45%醋酸溶液，迅速搗碎根尖，蓋上玻片，進(jìn)行擠壓，用橡皮頭輕輕搗，并且用火輕烤。

5.鏡檢 壓片后進(jìn)行鏡檢，把符合的玻片裝置進(jìn)行標(biāo)記，并且在冰箱之中凍結(jié)，取下蓋玻片，采用50%酒精—70%酒精—95%酒精—無水酒精+二甲苯，封片。

經(jīng)過試驗(yàn)證明，通過有效的預(yù)處理方式可以有效的菊科植物染色體標(biāo)本制備技術(shù)，這種方法一定程度上可以讓觀察者更好的觀察到菊科植物染色體的分布排列情況，可以很好的服務(wù)于后期的藥用價(jià)值研究。