TRIM24通過抑制EndoG核轉移保護缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡

王沙，王惠君，黃曉燕，王宗超，宋寶國，吳娟

缺血性心肌病是指冠狀動脈供血不足導致心臟損傷的一類疾病，是威脅人類生命健康的重大疾病[1]。而缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡是缺血性心肌病惡性進展的直接因素。TRIM24是TRIM家族中成員之一，也被稱為轉錄中介因子1α（TIF1α）[2]。在細胞中，其主要通過直接結合多種核受體而正向或負向調控核受體下游基因的轉錄活性[3]。近年來，大量研究指出TRIM24在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促進作用[4-6]。進一步研究表明，TRIM24可能在細胞增殖、凋亡等生物進程中發(fā)揮重要作用。這些研究均暗示TRIM24可能具有保護心肌細胞凋亡的作用，然而目前仍沒有關于TRIM24在缺血性心肌細胞凋亡中的研究。為此，我們針對TRIM24在心肌細胞凋亡中的作用進行了初步探究。我們首先建立了心肌細胞H9C2缺血再灌注損傷模型，并檢測了TRIM24及凋亡相關分子的變化；進一步使用TRIM24過表達H9C2心肌細胞驗證了TRIM24在缺血性心肌細胞凋亡中的作用。結果如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 H9C2心肌細胞來源于中國科學院上海細胞庫，在實驗室培養(yǎng)、傳代、凍存。

1.1.2 實驗試劑 DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；NotⅠ、EcoRⅠ、T4連接酶（南京諾唯贊公司）；質粒小提試劑盒（天根公司）；Lipofectamine 2000轉染試劑（ThermoFisher公司）；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）；RIPA蛋白裂解液（生工生物）；BCA蛋白定量試劑盒（生工生物）；細胞核漿蛋白分離提取試劑盒（碧云天）；TRIM24抗體（ThermoFisher公司）；Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3、GAPDH、Histone3、EndoG抗體（CST公司）。

1.2 實驗分組與缺血再灌注模型

1.2.1 實驗分組 H9C2細胞培養(yǎng)在60 mm培養(yǎng)皿內，前期實驗分為對照組（control）和缺血再灌注組（I-R），每組兩盤，并獨立重復三次實驗。后期實驗需要過表達TRIM24進行驗證，設置三組：對照+Scramble組、I-R+Scramble組、I-R+ov-TRIM24組，每組兩盤細胞，并獨立重復三次實驗。

1.2.2 缺血再灌注模型 H9C2細胞培養(yǎng)在P60培養(yǎng)皿內，待密度達到80%左右時進行缺血再灌注造模。H9C2細胞缺氧前將細胞培養(yǎng)基吸走，用PBS緩沖液液洗3遍，換成無糖DMEM培養(yǎng)液，放置于三期培養(yǎng)箱。 通入94%氮氣、5%二氧化碳以及1%氧氣的混合氣，培養(yǎng)12 h，隨后更換正常完全培養(yǎng)基，在5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，完成H9C2心肌細胞缺血再灌注模型。

1.3 實驗方法

1.3.1 TRIM24過表達質粒構建轉染 將大鼠TRIM24基因CDS序列克隆至pCDH-CMV載體上，酶切位點為NotⅠ和EcoRⅠ，使用大腸桿菌DH5α對TRIM24過表達質粒轉化擴增。使用Lipofectamine 2000轉染試劑根據說明書轉染TRIM24過表達質粒以及空白質粒Scramble到H9C2心肌細胞中，轉染后24 h在對相應細胞進行缺血再灌注處理。

1.3.2 心肌細胞全蛋白提取 培養(yǎng)皿培養(yǎng)的單層H9C2心肌細胞，棄去培養(yǎng)基后用預冷的 PBS 緩沖液洗2遍，每盤加入200 μl的RIPA蛋白裂解液，用細胞刮刀將其刮下并收集到1.5 ml EP管中。使用超聲破碎儀破碎細胞。12 000 g，4℃離心20 min，取上清到新的EP管中，使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。

1.3.3 核漿蛋白分離提取 培養(yǎng)皿培養(yǎng)的單層H9C2心肌細胞，棄去培養(yǎng)基后用預冷的PBS緩沖液洗2遍，根據細胞核漿蛋白分離提取試劑盒說明書逐步操作，分離獲得細胞核和細胞質蛋白樣品，使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。

1.3.4 Annexin V/PI凋亡檢測 培養(yǎng)皿培養(yǎng)的單層H9C2心肌細胞，棄去培養(yǎng)基后用預冷的PBS緩沖液洗2遍，用600 μl 0.25%胰酶消化50 s，立即使用細胞培養(yǎng)基中和胰酶。將細胞吹下，并收集到1.5 ml EP管中。1000 rpm，4℃離心4 min，棄去上清， 收集細胞后用500 μl ×Binding Buffer重懸，每管取 100 μl用來雙染。此外要設置空白組，F(xiàn)ITC-Annexin V單染組，PI單染組。室溫孵育15 min，使用BD FACSCalibur流式細胞儀檢測FL1和FL2通道熒光。

1.3.5 Western Blot檢測蛋白表達 將蛋白樣品配制成1×Loading Buffer蛋白溶液，根據定量結果上樣40 μg蛋白量；使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）將蛋白樣品進行電泳分離；電泳結束后，用濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，冰浴中100 V恒壓轉移1.5 h；2%BSA溶液封閉1 h；按說明書比例稀釋一抗（TRIM24，BAX，BCL-2，Cleaved caspase 3，EndoG，Histone3，GAPDH）并過夜孵育；TBS-T溶液洗膜并孵育相應的二抗，室溫下1 h；使用ECL發(fā)光液進行曝光成像。

1.3.6 統(tǒng)計學分析 本文采用 GraphPad Prism5 軟件進行數(shù)據統(tǒng)計分析，計量資料采用（x±s）表示，兩組之間的比較采用雙尾t檢驗，多組之間的比較采用One-Way ANONA及Tukey校正，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 缺血再灌注誘導心肌細胞凋亡及TRIM24表達下降 相比于對照組（1.26±0.065），缺血再灌注模型可以誘導明顯的心肌細胞凋亡（4.12±0.103，P＜0.001），同時檢測凋亡相關蛋白發(fā)現(xiàn)促凋亡蛋白Bax（1.98±0.031，P＜0.05）、cleaved-caspase3（4.71±0.087，P＜0.001）的表達明顯增加，抑凋亡蛋白Bcl-2表達下降（0.52±0.042，P＜0.05）；與此同時，我們也觀察到TRIM24表達的明顯下調（0.21±0.033，P＜0.001），這一結果暗示我們TRIM24可能具有抗凋亡作用。

2.2 過表達TRIM24可保護缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡 為了驗證TRIM24可能具有的抗凋亡作用，我們在H9C2心肌細胞系中過表達TRIM24（圖3A）后再進行缺血再灌注造模。利用流式細胞術檢測心肌細胞的凋亡情況我們可以看到，相比于對照組（5.3±0.83%），缺血再灌注能誘導明顯的心肌細胞凋亡（64.3±2.1%，P＜0.001）；而過表達TRIM24后能夠顯著降低缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡（11.4±0.97%，P＜0.001）。

圖2 缺血再灌注誘導凋亡相關蛋白及TRIM24的表達情況

圖3 過表達TRIM24可保護缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡

2.3 TRIM24通過調控線粒EndoG釋放入核保護心肌細胞凋亡 為了探究TRIM24保護缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡的分子機制，我們進一步檢測了凋亡相關基因的變化（圖4）。相比于缺血再灌注組（BAX：3.2±0.21；BCL-2：0.41±0.032；cleaved caspase3：4.71±0.097），可以明顯看到過表達TRIM24后能夠明顯的抑制BAX的高表達（1.08±0.031，P＜0.001）并增加BCL-2的表達（0.92±0.043，P＜0.05），但是對cleavedcaspase3的表達沒有影響（4.93±0.104）。這一結果表明TRIM24可能通過BAX/BCL-2調控線粒體穩(wěn)態(tài)來達到保護心肌細胞的目的。進一步，我們檢測的線粒體內凋亡相關蛋白核算內切酶EndoG的核轉移情況，結果可以看到相比于缺血再灌注組（7.64±0.113），TRIM24過表達后EndoG的釋放入核顯著下降（2.17±0.078，P＜0.001），進而阻止了缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡。

圖4 TRIM24對凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3的影響

圖5 TRIM24調控線粒體穩(wěn)態(tài)及EndoG釋放入核

3 討論

三結構域（TRIM）蛋白家族包含一個保守的RBCC結構域（RING-B-box-coiled-coil），目前在多細胞動物中已知超過60個家族成員[2]。TRIM蛋白超家族組成大多數(shù)E3泛素連接酶，在許多蛋白分子的翻譯后修飾中發(fā)揮著關鍵作用[7]。盡管TRIM蛋白超家族在心臟中的表達水平很高，但它們在心臟中的功能仍不明確。其中，一些TRIM超家族蛋白分子TRIM63、TRIM55以及TRIM54，也被分別稱為MuRF1、MuRF2、MuRF3，它們特異性表達于心肌和骨骼肌[8,9]。這些TRIM超家族蛋白分子會通過泛素-蛋白酶體依賴性通路降解肌節(jié)蛋白（如肌球蛋白，肌鈣蛋白Ⅰ）及肥大信號因子（如PKC，SRF及IGF-1等），進而調控心肌生長發(fā)育及其功能[6,10]。而且，最近研究表明TRIM63、TRIM55蛋白編碼基因的突變會造成心肌細胞內蛋白降解通路紊亂，進而導致肥厚性心肌癥[11-13]。在本次研究中，我們終點關注TRIM24。最近很多研究發(fā)現(xiàn)TRIM24在癌癥發(fā)生發(fā)展中的關鍵作用。TRIM24會與腫瘤蛋白p53直接作用，通過泛素化導致p53降解，進而影響到基因組穩(wěn)定性、細胞循環(huán)周期以及細胞凋亡[2]。此外，TRIM24還作為多個基因的轉錄中介因子或轉錄激活子發(fā)揮作用，其不僅可以通過與多個核受體相互作用發(fā)揮功能，也可以與組蛋白H3直接作用并調控基因甲基化水平[6]。TRIM24已成為多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個重要標志物。然而TRIM24在心臟中的作用仍未闡明。

近年來，雖然在心血管疾病的預防、檢查和治療方面都有了很大進步，但其仍是世界上發(fā)病率和死亡率的一個主要因素[14]。缺血性心臟病是由于動脈阻塞引起心肌血液供應減少導致的。一般情況下，心肌缺血會導致氧氣、營養(yǎng)物質供應不足以及有毒物質積累[1,15]。及時的血流恢復可以減少心肌損傷及死亡率。然而，在臨床上，血流的恢復經常會導致額外的心肌損傷及并發(fā)癥，被稱為缺血再灌注損傷。缺血再灌注損傷誘導的心肌細胞凋亡是缺血性心臟病惡性進展的關鍵因素[16,17]。在之前的研究中，TRIM24在細胞凋亡中發(fā)揮著重要的調控作用。為此，我們設計此次研究用以探究TRIM24在缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡中的作用。

本研究利用H9C2心肌細胞系構建細胞缺血再灌注模型。我們利用流式細胞術及凋亡相關蛋白表達水平檢測，實驗發(fā)現(xiàn)缺血再灌注明顯誘導心肌細胞凋亡增加。與此同時，我們檢測到TRIM24的蛋白表達水平在缺血再灌注處理后明顯降低。因此，我們猜測TRIM24可能具有抗心肌細胞凋亡的作用。

為了進一步驗證，我們通過過表達TRIM24確認其抗凋亡作用。流式細胞術結果顯示TRIM24過表達能夠明顯降低缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡。為了探究其中具體的分子機制，我們檢測了凋亡相關蛋白變化情況，結果顯示TRIM24過表達能明顯抑制BAX表達并增加BCL-2表達，但cleaved-caspase3沒有明顯變化。BAX和BCL-2在維持線粒體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[18-20]，這一結果指出TRIM24抑制的心肌細胞凋亡可能不是通過caspase級聯(lián)進行的，而是通過線粒體內凋亡相關蛋白的釋放進行的。為此，我們檢測了線粒體內凋亡相關蛋白核算內切酶EndoG的核轉移情況，實驗結果表明TRIM24過表達可以顯著抑制EndoG的核轉移，進而保護缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡。

綜上所述，本研究首次闡明了TRIM24在缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡中的作用及分子機制，即TRIM24通過調控BAX/BCL-2表達改善線粒體穩(wěn)態(tài)，進而減少線粒體內凋亡相關蛋白EndoG的核轉移，最終顯著緩解缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡。本研究為缺血再灌注誘導的心肌損傷的預防、治療提供了新的靶點與理論基礎。