車(chē)桑子小孢子發(fā)生與雄配子體發(fā)育

盧雪佳, 劉方炎, 高成杰, 李昆

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車(chē)桑子小孢子發(fā)生與雄配子體發(fā)育

盧雪佳, 劉方炎, 高成杰, 李昆*

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲(chóng)研究所，昆明 650224)

為了解干熱河谷區(qū)車(chē)桑子()胚胎學(xué)特征及其結(jié)籽率低的原因，采用常規(guī)石蠟切片法和電鏡掃描技術(shù)對(duì)車(chē)桑子小孢子發(fā)生、雄配子體發(fā)育和花粉的形態(tài)特征進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明，車(chē)桑子花藥具有4個(gè)花粉囊。完整的花藥壁從外到內(nèi)依次為表皮、藥室內(nèi)壁、2~3層中層細(xì)胞和絨氈層; 絨氈層類(lèi)型是腺質(zhì)絨氈層?；ㄋ幊墒炱?，中層、絨氈層均退化消失。小孢子母細(xì)胞進(jìn)行同時(shí)型胞質(zhì)分裂;四分體為四面體型結(jié)構(gòu)。成熟的花粉為二細(xì)胞型?；ǚ劢蛐?，外壁密布顆粒狀紋飾，具有3條不構(gòu)成合溝的萌發(fā)溝。雄性生殖發(fā)育過(guò)程出現(xiàn)的異?，F(xiàn)象可能是干熱河谷地區(qū)車(chē)桑子結(jié)籽率低的原因之一。

車(chē)桑子；小孢子；雄配子體；花粉；形態(tài)特征

車(chē)桑子()是無(wú)患子科(Sapin- daceae)車(chē)桑子屬的灌木或小喬木，廣泛分布于世界的熱帶和亞熱帶地區(qū)，我國(guó)主要分布于西南部、南部至東南部。以其為優(yōu)勢(shì)種組成的稀樹(shù)灌叢、灌叢或灌草叢是干熱河谷地區(qū)幾種重要的優(yōu)勢(shì)鄉(xiāng)土植被[1]。車(chē)桑子具有耐干旱、萌生能力強(qiáng)、根系發(fā)達(dá)和叢生性等生長(zhǎng)習(xí)性，常生長(zhǎng)于沙土、干旱山坡、曠地等處，是一種良好的保水固土植物[2]，常被用作我國(guó)西南干熱河谷地區(qū)造林的先鋒樹(shù)種，在困難立地植被恢復(fù)方面發(fā)揮著重要作用，具有較高的生態(tài)價(jià)值。

目前，對(duì)車(chē)桑子的研究主要集中在造林樹(shù)種的篩選[3]、光合特性及光合水分生理特性[4]、干旱脅迫下種子和幼苗生理指標(biāo)的變化[5]、種子的萌發(fā)特性和影響幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的生態(tài)因子[6–7]、旱生結(jié)構(gòu)特征[8]等。然而，有關(guān)車(chē)桑子繁殖特征和繁殖生物學(xué)的研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)采用常規(guī)石蠟切片和電鏡掃描技術(shù)對(duì)車(chē)桑子的小孢子發(fā)生和雄配子體的發(fā)育，以及花粉粒的形態(tài)特征進(jìn)行了觀察，為車(chē)桑子的生殖生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料,并試圖從生殖生物學(xué)方面分析其結(jié)籽率低的原因,為車(chē)桑子的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

車(chē)桑子()采自云南省楚雄自治州元謀縣國(guó)家林業(yè)局元謀荒漠生態(tài)系統(tǒng)定位研究站附近干熱河谷區(qū)域。選取植株中不同發(fā)育階段的雄花花蕾和花朵，保存于FAA固定液(50%酒精90 mL∶甲醛5 mL∶冰醋酸5 mL)中，4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。憑證標(biāo)本可見(jiàn)于中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所標(biāo)本館(KUN)的蠟葉標(biāo)本，采集人為滇西金沙江隊(duì)，采集號(hào)為6507。

1.2 方法

石蠟切片 從固定液中取出花蕾，經(jīng)系列脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋。用切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度為6~8m，番紅-固綠進(jìn)行對(duì)染, 蔡司光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

電鏡掃描 取即將開(kāi)放的花蕾，剝離出成熟花藥，輕輕劃破花藥表皮，擠壓出花粉粘于雙面導(dǎo)電膠布上，置于金屬樣品臺(tái)進(jìn)行噴金，在掃描電鏡下觀察并進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果和分析

2.1 花藥壁的發(fā)育

車(chē)桑子的花藥具有4個(gè)花粉囊，分為左、右兩半，中間由藥隔相連，花藥中4個(gè)花粉囊孢原細(xì)胞的出現(xiàn)具有不同步性(圖1: A)。在花藥4個(gè)角隅處表皮下均有較大體積、細(xì)胞核明顯的孢原細(xì)胞(圖1: B)。然后，孢原細(xì)胞經(jīng)過(guò)1次平周分裂，形成兩層細(xì)胞，即外層的初生壁細(xì)胞和內(nèi)層的造孢細(xì)胞(圖1: C)。初生壁細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行數(shù)次平周分裂形成4~5層細(xì)胞，最外層緊貼表皮的一層細(xì)胞為藥室內(nèi)壁, 中間為2~3層中層，最內(nèi)層為絨氈層。由此可見(jiàn), 完整的花藥壁由外向內(nèi)依次為表皮細(xì)胞(1層)、藥室內(nèi)壁細(xì)胞(1層)、中層細(xì)胞(2~3層)和絨氈層細(xì)胞(1層), 共5~6層細(xì)胞組成(圖1: D, E)。根據(jù)Davis的分類(lèi)[9], 車(chē)桑子的花藥壁發(fā)育屬于基本型。

在花藥逐漸成熟時(shí)，中層細(xì)胞受到擠壓變形, 絨氈層細(xì)胞出現(xiàn)退化解體的現(xiàn)象(圖1: J)。根據(jù)胡適宜的劃分，車(chē)桑子的絨氈層細(xì)胞是原位解體，屬于腺質(zhì)絨氈層[10]。當(dāng)花藥成熟時(shí)，同側(cè)兩個(gè)花粉囊之間的花粉囊壁破裂，兩個(gè)花粉囊相互溝通(圖1: K)。成熟的車(chē)桑子花藥開(kāi)裂方式為縱裂，裂口位于兩花粉囊交界處(圖1: L)。散粉時(shí)，花粉囊壁僅剩下表皮細(xì)胞殘余物和一層加厚伸長(zhǎng)的纖維層(圖1: M)。

2.2 小孢子發(fā)生

孢原細(xì)胞進(jìn)行平周分裂產(chǎn)生的內(nèi)層造孢細(xì)胞進(jìn)行多次分裂，形成次生造孢細(xì)胞。次生造孢細(xì)胞的細(xì)胞核較大、核仁明顯，細(xì)胞形狀呈多邊形，排列非常緊密(圖1: D)。次生造孢細(xì)胞發(fā)育形成小孢子母細(xì)胞，此時(shí)小孢子母細(xì)胞體積變大，逐漸趨于圓形，細(xì)胞質(zhì)較濃、細(xì)胞核較大、核仁明顯，為進(jìn)入減數(shù)分裂期做準(zhǔn)備，此時(shí)絨氈層細(xì)胞正常(圖1: E)。當(dāng)小孢子母細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行兩次細(xì)胞分裂后，形成了4個(gè)排列緊密的子細(xì)胞且被包圍在胼胝質(zhì)內(nèi),即四分體(圖1: F)，4個(gè)子細(xì)胞的排列方式為四面體，同時(shí)中層細(xì)胞受到擠壓逐漸退化解體，絨氈層細(xì)胞開(kāi)始部分出現(xiàn)解體現(xiàn)象。小孢子母細(xì)胞的整個(gè)減數(shù)分裂過(guò)程均被包圍在胼胝質(zhì)壁中。

2.3 雄配子體的發(fā)育

四分體后期，在胼胝質(zhì)酶的作用下，胼胝質(zhì)壁逐漸被溶解，四分體中的細(xì)胞彼此分離，形成了4個(gè)單核的花粉粒細(xì)胞。剛分離的單核花粉粒細(xì)胞的細(xì)胞核居中且明顯，此時(shí)絨氈層解體(圖1: G)。隨著單核花粉粒細(xì)胞逐漸擴(kuò)大，液泡的擠壓，細(xì)胞核開(kāi)始逐漸靠邊(圖1: H)。此時(shí)，花粉粒細(xì)胞進(jìn)行1次不均等的分裂, 形成1個(gè)較大的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和1個(gè)較小的生殖細(xì)胞(圖1: I)。二核花粉粒完全成熟時(shí),絨氈層和中層細(xì)胞全部解體。成熟花粉粒上可見(jiàn)萌發(fā)溝(圖1: I)。掃描電鏡下車(chē)桑子的花粉粒為近球形, 一般有3條萌發(fā)溝，極少見(jiàn)4和2條萌發(fā)溝。車(chē)桑子花粉粒的3條萌發(fā)溝不構(gòu)成合溝，花粉外壁密布顆粒狀的紋飾(圖1: P, Q)。極軸直徑為(24.91±2.03)m, 赤道軸直徑為(23.70±1.64)m。在車(chē)桑子雄配子體的發(fā)育過(guò)程中，觀察到部分?jǐn)∮ǚ?，主要表現(xiàn)出形狀各異、花粉粒干癟、皺縮、無(wú)核內(nèi)物質(zhì)，但這種花粉只少量出現(xiàn)。另外也觀察到部分花粉囊內(nèi)為空室(圖1: N, O)。

圖1 花藥發(fā)育過(guò)程。A: 花藥含有4個(gè)花粉囊; B: 孢原細(xì)胞(箭頭); C: 初生壁細(xì)胞和造孢細(xì)胞(箭頭); D: 初生造孢時(shí)期; E: 小孢子母細(xì)胞時(shí)期; F: 四分體; G: 小孢子單核居中期; H: 小孢子單核靠邊期; I: 成熟的花粉粒; J: 退化的絨氈層; K: 同側(cè)2個(gè)花粉囊相互連通; L: 花藥成熟時(shí)縱裂，裂口在2個(gè)藥室的連接處; M: 表皮和纖維層; M: 敗育花粉粒; O: 空的花粉囊; P: 成熟花粉粒(極面); Q: 成熟花粉粒(赤道面)。Ac: 孢原細(xì)胞; PP: 初生壁細(xì)胞; Ss:造孢細(xì)胞; Ta: 絨氈層; ML: 中層; MMC: 小孢子母細(xì)胞; En: 藥室內(nèi)壁; Ep: 表皮細(xì)胞; Tr: 四分體; FL: 纖維層。

3 討論

本試驗(yàn)觀察了車(chē)桑子的小孢子發(fā)生、雄配子體發(fā)育過(guò)程和花粉形態(tài)，車(chē)桑子具有4個(gè)花粉囊，橫切面呈蝶形，花藥壁由5~6層細(xì)胞構(gòu)成，從外至內(nèi)依次為1層表皮、1層藥室內(nèi)壁、2~3層中層和1層絨氈層，為腺性絨氈層，花藥壁的發(fā)育類(lèi)型為基本型。小孢子四分體為四面體型。成熟花粉粒為二核型。部分胚胎學(xué)特征與同科植物類(lèi)似，文冠果()、倒地鈴()和茶條木()的小孢子四分體均為四面體型、成熟花粉粒為兩核型[11–13]。車(chē)桑子花粉粒近球形，多具有3條萌發(fā)溝，稀2或4條萌發(fā)溝，表面密布顆粒狀紋飾，極軸為(24.91± 2.03)m，赤道軸為(23.70±1.64)m。而夏麗敏等[14]的研究表明，廣州龍洞地區(qū)的車(chē)桑子花粉極軸為(26.5±2.1)m、赤道軸為(25.0±1.86)m，本研究中車(chē)桑子采于元謀干熱河谷地區(qū)，其極軸和赤道軸均較小，表明車(chē)桑子的花粉大小可能存在區(qū)域差異, 且干熱河谷區(qū)花粉相對(duì)較小。本研究所獲得的車(chē)桑子的胚胎學(xué)特征，充實(shí)了無(wú)患子科胚胎學(xué)研究資料。此外，車(chē)桑子同一花序中雄蕊發(fā)育程度不同步，同一朵雄花中不同花藥發(fā)育程度不同，同一花藥的不同花粉囊發(fā)育程度不同步。這種現(xiàn)象在‘早籽銀桂’(‘Zao Zi Yin’)、‘晚銀桂’(‘Wan Yin’)中也有出現(xiàn)[15–16]，可能是為了延長(zhǎng)散粉時(shí)間，進(jìn)而增加授粉機(jī)會(huì)的一種適應(yīng)性機(jī)制。

在花藥的發(fā)育過(guò)程中，絨氈層位于花藥壁最內(nèi)層，直接與小孢子發(fā)育相關(guān)。絨氈層具有分泌功能，一方面能提供小孢子發(fā)育所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；另一方面能釋放胼胝質(zhì)酶溶解胼胝質(zhì)壁[17]。絨氈層在花粉發(fā)育過(guò)程中具有重要作用，絨氈層細(xì)胞提前或延遲降解或出現(xiàn)任何異常都有可能導(dǎo)致雄性不育及花粉敗育[18–19]。在‘晚銀桂’的花藥發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)了絨氈層提前退化現(xiàn)象，導(dǎo)致了花粉敗育[16]；鵝掌楸()也發(fā)生絨氈層細(xì)胞異?，F(xiàn)象而導(dǎo)致的雄性不育[20]。同科植物倒地鈴的絨氈層異?？赡軐?dǎo)致雌花雄性不育[13]，呂雪芹等[21]認(rèn)為文冠果絨氈層延遲解體或退化不徹底導(dǎo)致可孕花的花藥敗育。本試驗(yàn)觀察到部分絨氈層細(xì)胞在四分體時(shí)期已經(jīng)解體，由此推測(cè)，車(chē)桑子花藥發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)的敗育現(xiàn)象，可能與絨氈層提前退化有關(guān)。通常，特殊的外界環(huán)境條件和遺傳特性的原因會(huì)引起絨氈層以及雄配子體的異常發(fā)育，從而導(dǎo)致花粉敗育現(xiàn)象。環(huán)境因素導(dǎo)致了連翹()雄配子體不能正常發(fā)育進(jìn)而引起花粉敗育[22]；毛白楊()的花粉敗育則是異質(zhì)性遺傳與環(huán)境互作的結(jié)果[23]。本研究中，車(chē)桑子生長(zhǎng)于干濕季分明的干熱河谷地區(qū)，氣候特殊，旱季高溫干旱且漫長(zhǎng)(當(dāng)年11月至次年5月)，雨季易出現(xiàn)間歇性干旱[24]，因此，我們推測(cè)車(chē)桑子花藥壁的絨氈層和雄配子體的異常發(fā)育可能與惡劣的環(huán)境因素有關(guān)，這還有待于進(jìn)一步研究。

植物的有性生殖是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，且受內(nèi)因和外因的共同影響，植物生活史周期的任何一個(gè)環(huán)節(jié)都影響著生殖成功與否[25]。根據(jù)調(diào)查，車(chē)桑子的結(jié)籽率較低，僅為(22.5±2.5)%。初步判斷，花藥發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)的異?，F(xiàn)象可能是導(dǎo)致車(chē)桑子結(jié)籽率低的原因之一。為進(jìn)一步確定干熱河谷地區(qū)車(chē)桑子結(jié)籽率低、天然更新能力差[24]的原因，本研究將繼續(xù)從其他生殖生態(tài)方面，如花粉量和花粉萌發(fā)率、大孢子發(fā)生與雌配子體發(fā)育是否存在異常、受精過(guò)程是否有效、胚的發(fā)育是否正常、種子活力高低、種子萌發(fā)的狀況、環(huán)境對(duì)種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響等進(jìn)一步研究。這將為干熱河谷區(qū)車(chē)桑子的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

致謝 國(guó)家林業(yè)局元謀荒漠生態(tài)系統(tǒng)研究站劉昆友同志幫助采集了部分試驗(yàn)材料，資源昆蟲(chóng)研究所郭曉娟同學(xué)及西南林業(yè)大學(xué)嚴(yán)冬同學(xué)在試驗(yàn)過(guò)程提供了幫助。

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Microsporogenesis and Male Gametophyte Development of

LU Xue-jia, LIU Fang-yan, GAO Cheng-jie, LI Kun*

(Research Institute of Resource Insects, Chinese Academy of Forestry,Kunming 650224, China)

To understand the embryological characteristics ofin the dry and hot valley and the reasons for its low seed setting rate, microsporogenesis, male gametophyte development and pollen morphological characteristics ofwere studied with traditional paraffin sections and scanning electron microscopy. The results showed that the anther ofhad four pollen sac. The anther wall was composed of the epidermis, the endothecium, 2-3 middle layers, and tapetum (glandular tapetum) from the outside to the inside; at anther mature stage, the middle layer and tapetum denegerated and disappeared. The cytokinesis occurred simultaneously in a microspore mother cell; the tetrad was tetrahedral. The mature pollen was two-celled type. The mature pollen grain was nearly spherical with granular ornamentation on exine and 3 germ furrows which did not form syncolpate. Our researches showed that some abnormal phenomenon in male reproductive development might be one of the reasons of low seed setting rate.

; Microsporogenesis; Male gametophyte; Pollen; Morphological characteristics

10.11926/jtsb.3939

2018-05-04

2018-07-15

“十二五”國(guó)家科技計(jì)劃課題(2015BAD07B0404)；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFC0505101)資助

This work was supported by the National Science and Technology Plan in the Twelfth Five-Year Period (Grant No. 2015BAD07B0404), and the National Key Research and Development Planning Program of China (Grant No. 2017YFC0505101).

盧雪佳(1993~ )，女，碩士研究生。研究方向?yàn)榉雷o(hù)林。E-mail: 1771836520@qq.com

E-mail: caflikun@163.com