《中國(guó)藥典》2010版與2015版微生物限度檢查法對(duì)兩種制劑檢測(cè)結(jié)果的比較研究

賈 輝，姚 東，王作君，張敬一

0 引言

本研究以2013年“軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高專項(xiàng)科研課題”的總體要求作為依據(jù)，從各個(gè)方面對(duì)原軍規(guī)(《中國(guó)人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》)制劑復(fù)方碘溶液稀釋液和鹽酸環(huán)丙沙星魚肝油滴鼻乳進(jìn)行提升，包括對(duì)制劑處方進(jìn)行校正、對(duì)制劑的工藝中各詳細(xì)的參數(shù)進(jìn)行明確、增加了薄層鑒別項(xiàng)，建立了含量測(cè)定方法并進(jìn)行驗(yàn)證等，力求該制劑經(jīng)此研究之后，質(zhì)控水平與現(xiàn)行版中國(guó)藥典同步。

按照《中國(guó)藥典》2010版方法已經(jīng)建立和驗(yàn)證的復(fù)方碘溶液稀釋液和鹽酸環(huán)丙沙星魚肝油滴鼻乳微生物限度檢查法，但《中國(guó)藥典》2015版在試驗(yàn)培養(yǎng)基、菌種的選用、微生物計(jì)數(shù)及控制菌檢查方法等方面均有較大的修訂。本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[1-3]，采用兩種制劑(復(fù)方碘溶液稀釋液和鹽酸環(huán)丙沙星魚肝油滴鼻乳)，以《中華人民共和國(guó)藥典(2010版)》和《中華人民共和國(guó)藥典(2015版)》中的微生物限度檢查要求為依據(jù)，重新考察方法學(xué)并完成3次平行驗(yàn)證，從而對(duì)兩種方法之間的差別進(jìn)行比較，確定并驗(yàn)證改進(jìn)后測(cè)定方法的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)提出選用薄膜過濾法對(duì)這兩種制劑進(jìn)行微生物限度檢查，排除干擾徹底，方法可行，適合作為復(fù)方碘溶液稀釋液和鹽酸環(huán)丙沙星魚肝油滴鼻乳的藥檢室常規(guī)檢查方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 生物安全柜(型號(hào)：BSC-ⅡA2，上海上凈凈化設(shè)備有限公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：DH6000 BⅡ，AISITE)，4 ℃恒溫冰箱(廣東科龍)，霉菌生化培養(yǎng)箱(spx-250BⅢ)，立式壓力蒸汽滅菌鍋(型號(hào)：YXQ-LS-50A，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)，集菌儀(型號(hào)：Htyteritest 601，杭州泰林醫(yī)療器械廠)，一次性薄膜過濾器(規(guī)格：HTY-101，浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司)。

1.2 菌種 金黃色葡萄球菌菌株[CMCC(B)26003]，大腸埃希菌菌株[CMCC(B)44102]，枯草芽孢桿菌菌株[CMCC(B)63501]，黑曲霉菌菌株[CMCC(B) 98003]，白色念珠菌菌株[CMCC(F)10123]，銅綠假單胞菌菌株[CMCC(B)10104]，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3 培養(yǎng)基 氯化鈉蛋白胨緩沖液(批號(hào)：101123)，膽鹽乳糖培養(yǎng)基(批號(hào)：111117)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：100522)，乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基(批號(hào)：100224)，胰酪大豆胨培養(yǎng)基(瓊脂)(批號(hào)：141125)，胰酪大豆胨培養(yǎng)基(液體)(批號(hào)：140903)，沙氏葡萄糖培養(yǎng)基(瓊脂)(批號(hào)：140513)，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：100407)，pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液(批號(hào)：121105)，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)：110517)，麥康凱培養(yǎng)基(液體)(批號(hào)：131230)，麥康凱培養(yǎng)基(瓊脂)(批號(hào)：140926)，蛋白胨水培養(yǎng)基(批號(hào)：121022)，均購(gòu)自于北京三藥科技開發(fā)公司。

1.4 試藥 復(fù)方碘溶液稀釋液(規(guī)格：100 ml/瓶，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院生產(chǎn)，批號(hào)：20141210、20150108、20150307)，鹽酸環(huán)丙沙星魚肝油滴鼻乳(規(guī)格：8 ml/支，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院生產(chǎn)，批號(hào)：20150323、20150505、20150614)。

2 方法與結(jié)果

2.1 微生物限度檢查制備方法(2010年版《中國(guó)藥典》)

2.1.1 各類試驗(yàn)菌液的制備(大腸埃希菌菌株、金黃色葡萄球菌菌株、枯草芽孢菌菌株) 將新鮮培養(yǎng)的各菌株培養(yǎng)物接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯的培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱(30～35 ℃)中，培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)18～24 h。精密吸取1 ml培養(yǎng)物，加入9 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，制成含菌數(shù)為50～100 cfu/ml的菌懸液。用于控制菌驗(yàn)證時(shí)，制備成每1 ml含菌落數(shù)<100 cfu的菌懸液。

白念菌液的制備：將白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱(23～28 ℃)中，培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)24～48 h。培養(yǎng)物精密吸取1 ml，加入9 ml 的0.9%無菌氯化鈉溶液，制成的菌懸液濃度為含菌數(shù)50～100 cfu/ml。

黑曲菌液的制備：將黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物接種到改良馬丁培養(yǎng)基的瓊脂斜面上，放置于培養(yǎng)箱(23～28 ℃)中，培養(yǎng)約1周(5～7 d)，加入含0.05%(v/v)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液3～5 ml，將黑曲霉菌孢子慢慢洗脫。用吸管(帶有棉花濾過功能)將菌液緩慢吸出至無菌的試管中，用0.9%無菌氯化鈉溶液[含0.05%(v/v)聚山梨酯80]，制成黑曲霉菌菌懸液濃度為含霉菌孢子數(shù)50～100 cfu/ml。

2.1.2 供試液制備 用移液管精密量取10 ml復(fù)方碘溶液稀釋液，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，混勻，制成的供試液比例為1∶10。

取鹽酸環(huán)丙沙星魚肝油滴鼻乳10 ml，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，混勻，靜置10 min，取上清液，制成的供試液比例為1∶10。

2.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn) ①計(jì)數(shù)試驗(yàn)-細(xì)菌、霉菌、酵母菌(采用薄膜過濾法)：將配制好的1∶10供試液1 ml注入薄膜過濾器中，每膜約用300 ml或500 ml沖洗液(pH 7.0蛋白胨-氯化鈉緩沖液)，沖洗3～5次，在最后一次沖洗液中用注射器注入50～100 cfu試驗(yàn)菌液，抽干后輕取膜，貼于預(yù)先鋪至好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中央上，倒置培養(yǎng)，按薄膜過濾法，同法測(cè)定其菌落數(shù)，對(duì)菌液組和供試品對(duì)照組的菌落數(shù)進(jìn)行測(cè)定。按公式 [各菌株的回收率(%)=(試驗(yàn)組菌落平均數(shù)-供試品對(duì)照組菌落平均數(shù))/ 菌液組的菌落平均數(shù)×100%] 計(jì)算各菌株回收率，結(jié)果見表1。

②檢查控制菌-大腸埃希菌菌株、銅綠假單胞菌菌株和金黃色葡萄球菌菌株的檢查：各取供試液(1∶10比例)10 ml并相應(yīng)的菌懸液1 ml，加至100 ml的相應(yīng)培養(yǎng)基中，按2010年版《中國(guó)藥典》控制菌檢驗(yàn)方法檢查[4-5]進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表2。

表1 《中國(guó)藥典》2010版兩種制劑細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果

表2 《中國(guó)藥典》2010版兩種制劑控制菌檢查試驗(yàn)結(jié)果

2.2 微生物限度檢查方法(2015年版《中國(guó)藥典》)

2.2.1 各試驗(yàn)菌液的制備(大腸埃希菌菌株、金黃色葡萄球菌菌株、枯草芽孢桿菌菌株、銅綠假單胞菌菌株) 將新鮮培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種至培養(yǎng)基(胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基)中，置于培養(yǎng)箱(30～35 ℃)中，培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)為18～24 h；精密吸取1 ml培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液將菌懸液配制成合適的濃度。在進(jìn)行控制菌驗(yàn)證時(shí)，用于制成每1 ml含菌落數(shù)<100 cfu的菌懸液。

白念菌液的配制：將新鮮培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種至培養(yǎng)基(沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基)中，置于霉菌培養(yǎng)箱(20～25 ℃)中，培養(yǎng)時(shí)間為2～3 d；用0.9%的無菌氯化鈉溶液將培養(yǎng)物制成合適濃度的白念菌懸液[6]。

黑曲菌液的配制：將新鮮培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種至培養(yǎng)基(沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)斜面上，放置于霉菌培養(yǎng)箱(20～25 ℃)中，培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)5～7 d，加入0.9%無菌氯化鈉溶液[含0.05%(v/v)吐溫80]3～5 ml，緩慢地將黑曲霉菌孢子洗脫下來。用吸管(帶有棉花濾過)將菌液吸出至無菌的試管中，用0.9%的無菌氯化鈉溶液[含0.05%(v/v)吐溫80]制成合適濃度的黑曲霉菌懸液[6]。

2.2.2 供試液的制備 用移液管精密量取10 ml復(fù)方碘溶液稀釋液，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，混勻，供試液比例為1∶10。

取鹽酸環(huán)丙沙星魚肝油滴鼻乳10 ml，加入緩沖液(pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨)至100 ml，混勻，靜靜放置10 min，吸取上清液，作為1∶10的供試液。

2.2.3 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn) ①需氧菌總數(shù)的檢查(薄膜過濾法)：取配制好的1∶10供試液10 ml，置于已經(jīng)滅菌的試管中，加入相應(yīng)試驗(yàn)菌液0.1 ml，從而使其最終濃度為菌落數(shù)不大于100 cfu/ml，反復(fù)吹打數(shù)次混合均勻，用移液管從試管中轉(zhuǎn)移1 ml注入100 ml的緩沖液(pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨)中，慢慢濾過，分次沖洗，抽干后，用鑷子取膜，輕輕貼于預(yù)先鋪好的胰酪大豆胨瓊脂平板上，倒置培養(yǎng)，完成試驗(yàn)組菌落數(shù)的測(cè)定，以相同的方法進(jìn)行菌液組和供試品對(duì)照組菌落數(shù)測(cè)定。

按公式[各菌株回收率=(試驗(yàn)組的菌落平均數(shù)-供試品對(duì)照組的菌落平均數(shù))/ 菌液對(duì)照組的菌落平均數(shù)]計(jì)算各菌株的回收率，結(jié)果見表3。

②霉菌和酵母菌總數(shù)檢查：用移液管精密量取10 ml的1∶10供試液于滅菌試管中，注入0.1 ml相應(yīng)的試驗(yàn)菌液使其最終菌液濃度為每1 ml不大于100 cfu，反復(fù)吹打數(shù)次混合均勻，用移液管從試管中轉(zhuǎn)移1 ml注入100 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨的緩沖液中，濾過，沖洗，抽干，用鑷子取膜，輕貼于沙氏葡萄糖瓊脂平板上，培養(yǎng)溫度20～25 ℃，完成試驗(yàn)組菌落數(shù)的測(cè)定，相同的方法進(jìn)行菌液組和供試品對(duì)照組的菌落數(shù)的測(cè)定。

按照公式[各菌株回收率=(試驗(yàn)組的菌落平均數(shù)-供試品對(duì)照組的菌落平均數(shù))/菌液對(duì)照組組的菌落平均數(shù)]計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

2.2.4 檢查控制菌(大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌) 用移液管各精密量取10 ml的供試液(比例為1∶10)并相應(yīng)的菌懸液1 ml，注入100 ml的胰酪大豆胨培養(yǎng)基(液體)中，按2015年版《中國(guó)藥典》中控制菌檢驗(yàn)方法檢查[7]進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表5。

2.3 三批樣品的檢測(cè)及結(jié)果比較 分別取2種制劑的3批樣品，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依據(jù)新舊版藥典的方法檢查。兩種方法檢驗(yàn)結(jié)果的比較見表6、表7。

3 討論

3.1 復(fù)方碘溶液稀釋液為口服補(bǔ)碘劑，具有調(diào)節(jié)甲狀腺功能的作用，用于單純性甲狀腺腫及甲狀腺功能亢進(jìn)者手術(shù)前的輔助用藥；鹽酸環(huán)丙沙星魚肝油滴鼻乳可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，減少炎性糜爛，潤(rùn)滑鼻黏膜，促進(jìn)黏膜血液循環(huán)，用于萎縮性鼻炎及其他原因引起的鼻黏膜干燥等癥。因兩種制劑均具有一定的抗菌消炎作用，在微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)中有抑菌現(xiàn)象，因此，在考察了常規(guī)平皿法、直接接種法、培養(yǎng)基稀釋法的基礎(chǔ)之上，本研究選用薄膜過濾法進(jìn)行兩種制劑的微生物限度檢查。

表3 《中國(guó)藥典》2015版方法兩種制劑需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果

表4 《中國(guó)藥典》2015版方法兩種制劑霉菌、酵母菌總數(shù)試驗(yàn)結(jié)果

表5 《中國(guó)藥典》2015版方法控制菌適用性檢查結(jié)果

表6 兩種方法檢測(cè)3批樣品微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果比較

表7 兩種方法檢測(cè)3批樣品控制菌檢查試驗(yàn)結(jié)果比較

注：“—”表示無需檢測(cè)

3.2 2010版和2015版藥典在回收率的計(jì)算和控制范圍兩個(gè)方面均有修訂 2010版藥典的回收率結(jié)果用百分比“%”表示，回收率不低于70%為合格；而2015版藥典回收用數(shù)值表示，回收在0.5～2.0范圍之間合格。相比較而言，2015版藥典回收率的范圍更寬。

3.3 控制菌的檢查中存在增菌培養(yǎng)的重要步驟 在細(xì)菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)的過程中有明顯抑菌的品種，在控制菌的檢查過程中采用最為方便常用的直接接種法就能檢出試驗(yàn)菌株。對(duì)抑菌活性較強(qiáng)而常規(guī)方法不能排除的制劑品種，筆者選用直接接種法和培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行了試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩種方法均有干擾，故需要采用薄膜過濾法才能取得好的效果[8-9]。為使檢查結(jié)果獲得良好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，培養(yǎng)基注入時(shí)體積應(yīng)盡量保持一致，且方法驗(yàn)證需進(jìn)行3次獨(dú)立完整的平行試驗(yàn)，這一原則貫穿整個(gè)試驗(yàn)始終。

4 結(jié)論

綜上所述，無論《中國(guó)藥典》2010版，還是2015版，復(fù)方碘溶液稀釋液和鹽酸環(huán)丙沙星魚肝油滴鼻乳微生物限度均選擇采用薄膜過濾法對(duì)細(xì)菌、霉菌及酵母菌及控制菌進(jìn)行限度檢查，且兩版藥典的試驗(yàn)結(jié)果基本一致，但新版藥典的專屬性更高，出現(xiàn)假陽性的幾率更低，2015版《中國(guó)藥典》中收載的微生物限度檢查法更適合藥物制劑的微生物限度檢查。