單域抗體在腫瘤分子影像學(xué)中的研究進(jìn)展

張美欣，劉特立，郭曉軼，徐曉霞，朱華，楊志

0 引言

分子影像（molecular imaging）是近年來(lái)發(fā)展迅速并且極具醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值的用于顯示細(xì)胞和亞細(xì)胞水平的特定靶向分子的成像技術(shù)。分子影像技術(shù)較經(jīng)典影像技術(shù)例如CT、經(jīng)典MRI、X射線而言，具有較高的敏感度和特異性，并且涉及分子生物學(xué)、化學(xué)、光學(xué)、放射醫(yī)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域，臨床應(yīng)用范圍廣，潛在的研究?jī)r(jià)值高。目前，分子影像學(xué)包括光學(xué)成像、PET/SPECT成像、超聲造影技術(shù)等。分子成像的發(fā)展依賴于分子探針的開發(fā)，分子探針可以與靶向分子結(jié)合并能產(chǎn)生影像學(xué)信號(hào)，從而被示蹤的分子。目前常見的分子探針包括與放射性核素、生物素、順磁性粒子、熒光素等物質(zhì)化學(xué)偶聯(lián)的多肽、單克隆抗體、寡聚核苷酸等。尋找和研發(fā)敏感度更高、特異性更強(qiáng)、信噪比更高的分子探針是科研人員持續(xù)關(guān)注的話題。本文總結(jié)了一類可以作為分子探針開發(fā)方向的抗體——單域抗體（single-domain antibody, sdAb）的基本情況及它在分子成像中的應(yīng)用，以期為該領(lǐng)域的研究提供幫助。

1 單域抗體的基本情況

1.1 單域抗體的分子結(jié)構(gòu)

傳統(tǒng)抗體的基本結(jié)構(gòu)是由四條多肽鏈組成的“Y”型蛋白質(zhì)。這四條多肽鏈包括兩條完全相同的重鏈和兩條完全相同的輕鏈，彼此通過(guò)二硫鍵連接，由此形成了異型四聚體（heterotetramer）。傳統(tǒng)抗體的重鏈和輕鏈由可變區(qū)（分別稱為VH和VL）和恒定區(qū)（分別稱為CH和CL）組成，見圖 1。

圖1 抗體結(jié)構(gòu)示意圖Figure1 Schematic diagram of antibodies

1993年，Hamers-Casterman教授[1]在分析單峰駱駝血清中的免疫球蛋白G分子（IgG）時(shí)，偶然發(fā)現(xiàn)除了常規(guī)的IgG1（MW～150 kDa）之外，還有兩種其他結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白組分IgG2和IgG3（MW～90 kDa）存在，IgG2和IgG3為缺乏輕鏈、僅含有重鏈的抗體（heavy-chain antibodies，HCAbs），為重鏈的同型二聚體（homo-dimeric heavy-chain），其占所有血清IgG的75%。1995年，Greenberg等[2]研究發(fā)現(xiàn)了護(hù)士鯊（nurse shark）體內(nèi)存在大量HCAbs，證實(shí)了HCAbs的存在。感染了伊氏錐蟲的駱駝的抗體通過(guò)放射免疫沉淀和印跡實(shí)驗(yàn)[3]顯示出IgG2和IgG3的重鏈部分具有強(qiáng)結(jié)合活性。

目前普遍認(rèn)為HCAbs和傳統(tǒng)抗體相比具有如下分子及結(jié)構(gòu)特征。首先，重鏈的同型二聚體缺少輕鏈及第一個(gè)恒定區(qū)，VH直接通過(guò)鉸鏈區(qū)與抗體Fc段結(jié)合。HCAbs缺乏CH1區(qū)，可能是由CH1區(qū)外顯子和內(nèi)含子邊界存在的非剪接位點(diǎn)上的點(diǎn)突變所導(dǎo)致[3-4]。其次，VH的FR2中有4位疏水性氨基酸被親水性氨基酸所取代，即Val42→Phe/Tyr、Gly49→Glu、Leu50→Arg/Cys和Trp52→Gly/Phe[5-6]。這些疏水性氨基酸向親水性氨基酸的突變是HCAbs的重鏈不與輕鏈配對(duì)的原因之一，也阻止了單域抗體（從HCAbs中提取出來(lái)的重鏈可變區(qū)），也稱單域重鏈抗體（variable domain of the heavy-chain antibody, VHH）的聚合。此外，VHH與異型四聚體的VH相比，有更長(zhǎng)的CDR3，VHH的CDR3大致由16～24個(gè)氨基酸組成[7]，有些單域抗體的CDR3甚至超過(guò)25個(gè)氨基酸[8]，而傳統(tǒng)單抗的CDR3僅有7～12個(gè)氨基酸。這種長(zhǎng)CDR3結(jié)構(gòu)形成的凸環(huán)可以結(jié)合到抗原分子的隱蔽的抗原表位，彌補(bǔ)了單域抗體缺少輕鏈導(dǎo)致的抗原結(jié)合能力下降[7]。最后一點(diǎn)區(qū)別是，單峰駝VHH種系基因編碼CDR1中的Cys殘基，而在所有VH種系基因（包括單峰駝的那些基因）中都不存在這些位置的Cys殘基。此外，VHH的CDR3中的第二個(gè)Cys僅在VHH-D-JH基因的重組過(guò)程中被引入。這些額外的Cys殘基形成額外的環(huán)間二硫鍵，以穩(wěn)定較長(zhǎng)的CDR3[9]。

1.2 單域抗體的生物學(xué)特性

對(duì)基因組和cDNA文庫(kù)進(jìn)行基因的同源性分析，發(fā)現(xiàn)駱駝VHH基因與人類Ⅲ族VH3結(jié)構(gòu)域的編碼基因高度同源。因此，駱駝來(lái)源的單域抗體在人體中是弱免疫原性的[10]。除了弱免疫原性外，單域抗體具有很好的高熱穩(wěn)定性和重折疊能力，甚至在暴露于極端條件下，如極低或高pH值和高溫時(shí)也表現(xiàn)出高溶解度和重折疊能力。這種能力可能與疏水性氨基酸的突變有關(guān)[11]。Ladenson等[12]分離和鑒定了來(lái)自美洲駝的咖啡因特異性重鏈抗體片段（VHH），其中一個(gè)VHH片段（VSA2）表達(dá)為可溶性蛋白質(zhì)，能夠在70℃結(jié)合咖啡因，在暴露于高達(dá)90℃的溫度后仍能恢復(fù)其反應(yīng)性。

常規(guī)抗體滲透入實(shí)體瘤、穿過(guò)血腦屏障較困難，單域抗體與常規(guī)抗體相比，在組織中的穿透率更高，并且具有快速的血液清除率[13]，因此能快速地到達(dá)腫瘤部位，使其能被理想地應(yīng)用于各種生物技術(shù)和治療。此外，sdAbs可以融合其他蛋白質(zhì)或多肽，從而被克隆成各種組合形式。sdAb可以被串聯(lián)克隆成具有不同特異性的sdAb，例如血清白蛋白，可協(xié)助sdAb靶向特定區(qū)域，或有助于增加試劑的體內(nèi)半衰期，避免治療過(guò)程中較高的藥物清除率導(dǎo)致的高劑量給藥和頻繁給藥[14]。單價(jià)sdAbs可以與放射性同位素、熒光染料、生物素、磁珠、親和基質(zhì)等化學(xué)綴合。放射性標(biāo)記的sdAbs可用于體內(nèi)腫瘤成像[15]，見圖 1。

2 單域抗體在分子影像中的應(yīng)用

2.1 單域抗體在PET/SPECT中的應(yīng)用

靶向分子成像探針一般為放射性標(biāo)記的單克隆抗體（mAb）。單克隆抗體的主要缺點(diǎn)是它們?cè)谘褐械耐Ａ魰r(shí)間從幾天到幾周不等，在注射后2～4天，靶組織與周圍組織之間才有放射性信號(hào)的峰值對(duì)比。因此需要使用長(zhǎng)半衰期的放射性核素如89Zr（t1/2=78.4 h）或124I（t1/2=100.3 h）進(jìn)行放射性標(biāo)記[16]。Menke-van der Houven van Oordt等[17]報(bào)道了89Zr標(biāo)記的西妥昔單抗（屬于嵌合型IgG1單克隆抗體，靶向EGFR）在晚期結(jié)直腸癌患者中的PET顯像情況。結(jié)果顯示，注射后的第6天為顯像的最佳時(shí)間點(diǎn)，因此，mAb的動(dòng)力學(xué)過(guò)慢。相比之下，VHH片段能從血液中被快速清除，并且可以用短半衰期的放射性核素如68Ga（t1/2=68 min）、18F（t1/2=110 min）或64Cu（t1/2=12.7 h）等進(jìn)行標(biāo)記。

例如，Keyaerts等[18]報(bào)道了68Ga標(biāo)記的靶向HER2分子的單域抗體在乳腺癌患者體內(nèi)的PET/CT顯像。單域抗體具有快速代謝的特性，因此注射單域抗體后較早的時(shí)間點(diǎn)就可以進(jìn)行成像，且注射后60～90 min顯像效果達(dá)到最佳狀態(tài)。其生物分布特征有利于通過(guò)分子影像技術(shù)檢測(cè)腫瘤：其在腎、肝和腸中攝取最高，但在檢測(cè)原發(fā)性乳腺癌或腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)，其他器官的背景水平非常低[18]。

Huang等[15]研究的靶向EGFR的單域抗體8B6顯示出對(duì)EGFR過(guò)表達(dá)細(xì)胞的高特異性和選擇性結(jié)合。99mTc-8B6通過(guò)SPECT分析，能夠在體內(nèi)檢測(cè)出中高度EGFR過(guò)表達(dá)的腫瘤。同時(shí)，生物分布實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了單域抗體對(duì)體內(nèi)腫瘤成像的適用性。在腫瘤部位，定量聚集的核素標(biāo)記的抗EGFR單域抗體有望監(jiān)測(cè)表達(dá)EGFR的腫瘤治療情況[19]。

除了HER2和EGFR位點(diǎn)外，靶向CEA位點(diǎn)的單域抗體也被研究人員廣泛開發(fā)并應(yīng)用于分子影像。Vaneycken等[20]用99mTc標(biāo)記了靶向CEA位點(diǎn)的單域抗體NbCEA5和人源化CEA5抗體，并進(jìn)行了SPECT顯像。分析顯示，99mTc-NbCEA5和99mTc標(biāo)記的人源化CEA5抗體注射后1小時(shí)，分別觀察到較強(qiáng)的腫瘤攝取?？偠灾?，快速的探針清除，高效的腫瘤靶向與低背景信號(hào)等特點(diǎn)相結(jié)合，促成了NbCEA5和人源化CEA5抗體在顯像結(jié)果中的高腫瘤-正常組織信號(hào)比。

2.2 單域抗體在光學(xué)影像中的應(yīng)用

單域抗體也可以與合適的熒光團(tuán)結(jié)合，用來(lái)進(jìn)行腫瘤的光學(xué)成像[21]。近紅外（Near Infrared，NIR）熒光團(tuán)的發(fā)展使這種成像方式具有高度的靈活性、敏感度、速度和成本效益[18]。

van Brussel等[22]開發(fā)了一種與近紅外熒光團(tuán)IRDye800CW偶聯(lián)的碳酸酐酶9（carbonic anhydrase Ⅸ, CAⅨ, 可被作為區(qū)分癌癥與非癌性組織的標(biāo)志物）特異性單域抗體，證明這種探針在手術(shù)前和手術(shù)過(guò)程中可應(yīng)用于缺氧前侵襲性乳腺癌的光學(xué)分子成像。同時(shí)研究證實(shí)CAⅨ特異性常規(guī)抗體（MabCAⅨ）還能進(jìn)行DCIS（導(dǎo)管原位癌）的光學(xué)成像，在注射后的24小時(shí)內(nèi)，抗體的緩慢清除率導(dǎo)致了不理想的熒光信號(hào)對(duì)比，并且在探針給藥后72小時(shí)才獲得最佳的腫瘤-正常組織信號(hào)比；而在單域抗體探針給藥后2小時(shí)就已經(jīng)達(dá)到了腫瘤-正常組織的高對(duì)比度。使用單域抗體的主要優(yōu)點(diǎn)是可以獲得更快的清除率和圖像采集以及更高的對(duì)比度，這種藥代動(dòng)力學(xué)使探針注射和外科手術(shù)可以在同一天進(jìn)行。

Oliveira等[23]開發(fā)了一種抗EGFR單域抗體探針，并用于光學(xué)分子成像。作者將抗EGFR單域抗體7D12和西妥昔單抗分別與近紅外熒光團(tuán)IRDye800CW偶聯(lián)。注射后30分鐘，7D12-IR就可腫瘤顯影，而在注射西妥昔單抗-IR的動(dòng)物體內(nèi)，在腫瘤部位沒有觀察到高于背景的信號(hào)。腫瘤中IR綴合蛋白的定量分析顯示，在注射7D12-IR后2小時(shí)的腫瘤攝取，顯著高于注射西妥昔單抗-IR后24小時(shí)腫瘤的攝取。這種差異與腫瘤內(nèi)7D12-IR的優(yōu)越滲透和分布有關(guān)。這些結(jié)果表明，與NIR熒光團(tuán)結(jié)合的抗EGFR單域抗體具有優(yōu)異的性能，在臨床前快速光學(xué)成像和患者補(bǔ)充診斷中很有應(yīng)用前景。

2.3 單域抗體在超聲造影中的應(yīng)用

雖然光學(xué)成像具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也存在著劣勢(shì)。研究人員旨在克服深部組織中由光散射造成的限制，但仍處于起步階段。超聲是一種安全、快速和廉價(jià)的被廣泛使用的醫(yī)療診斷技術(shù)。最近，基于單域抗體的新型分子超聲造影劑的開發(fā)已有報(bào)道，并在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均得到證實(shí)[24]。

超聲成像越來(lái)越多地使用靶向微泡（MB）來(lái)評(píng)估疾病進(jìn)展期間出現(xiàn)的血管內(nèi)分子事件。MBs通?？梢栽鰪?qiáng)超聲成像的對(duì)比度。Hernot等[24]成功地將增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein, eGFP）特異性單域抗體（cAbGFP4）與偶聯(lián)生物素的微泡MBs偶聯(lián)，并證實(shí)了MB-cAbGFP4與eGFP的特異性結(jié)合，以及MB-cAbVCAM1-5在快速流動(dòng)時(shí)結(jié)合血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1, VCAM-1）的能力。MB-cAbVCAM1-5在腫瘤血管中的結(jié)合不僅允許腫瘤狀態(tài)的成像，而且可以進(jìn)行靶向治療。值得注意的是，當(dāng)用對(duì)比特異性超聲成像模式成像時(shí)，VCAM-1靶向的MBs在MC38腫瘤血管系統(tǒng)中的黏附顯著高于非VCAM-1靶向的MBs。因此，共價(jià)連接到MB上的人源化單域抗體應(yīng)該被考慮用于臨床前開發(fā)評(píng)估，并且有望進(jìn)入臨床實(shí)踐中。

3 展望

盡管單域抗體存在諸多優(yōu)點(diǎn)，其開發(fā)利用也很具有前景，但是單域抗體也存在著一些劣勢(shì)。單域抗體的分子量可達(dá)約15 kDa，直徑和長(zhǎng)度分別僅有約2.5 nm和4 nm。這種小分子特征有時(shí)對(duì)于改造和臨床應(yīng)用是不利的。例如，單域抗體與熒光團(tuán)等成像標(biāo)記物聯(lián)合時(shí)，單域抗體的結(jié)合特性可能發(fā)生改變[25]。此外，在某些情況下，觀察到放射性標(biāo)記單域抗體在腎臟和肝臟中的攝取量較高，這不僅會(huì)對(duì)肝臟和腎臟產(chǎn)生不良結(jié)果，還限制了肝臟和腎臟附近的待測(cè)分子的檢測(cè)敏感度[16,26-27]。并且單域抗體的快速清除阻礙了其與疾病部位的所有表位的最佳結(jié)合，導(dǎo)致疾病部位攝取量減少，也可能限制單域抗體進(jìn)行免疫治療的效果。盡管通過(guò)很多方法可以實(shí)現(xiàn)單域抗體半衰期的顯著增加，但是因?yàn)閱斡蚩贵w中不存在效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，其在免疫治療中的功效比傳統(tǒng)抗體低得多[28]。盡管不適用于治療應(yīng)用，基于單域抗體技術(shù)的下一代分子成像劑的開發(fā)仍然非常有前景。

此外，單域抗體的非人源特征可能使其在人體內(nèi)引起抗單域抗體免疫應(yīng)答。盡管單域抗體與VHⅢ家族的人VH基因的大序列具有同一性和快速血液清除率，使其被認(rèn)為具有低免疫原性[16]，但是單域抗體和VH仍有約10個(gè)不同的氨基酸，以確保不存在VL結(jié)構(gòu)域時(shí)，單域抗體具有最大的溶解度和穩(wěn)定性。若想實(shí)現(xiàn)臨床多種手段相結(jié)合的長(zhǎng)期治療，需要進(jìn)一步將單域抗體的氨基酸序列人源化[29]。

4 小結(jié)

分子影像作為腫瘤診斷的重要技術(shù)以及腫瘤治療領(lǐng)域具有廣闊前景的學(xué)科，在腫瘤學(xué)研究中發(fā)揮著舉足輕重的作用。研究人員當(dāng)前正致力于開發(fā)更新型的有臨床優(yōu)勢(shì)的探針。單域抗體以其穩(wěn)定性強(qiáng)、免疫原性弱等諸多優(yōu)勢(shì)得到研究者的關(guān)注，隨著單域抗體制備技術(shù)的優(yōu)化和新生產(chǎn)工藝的出現(xiàn)，以單域抗體為核心的新型分子探針有望為腫瘤的診療提供全新的方法。