谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)載體ASCT2在腫瘤中的研究進(jìn)展

王雅樂，黃承浩

0 引言

腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)需要大量能量，還原力，及合成高分子所必需的前體物質(zhì)[1]。谷氨酰胺是人體血漿中含量最豐富的游離氨基酸，它與葡萄糖聯(lián)合能夠最大程度地滿足腫瘤細(xì)胞在合成代謝中對(duì)能量和中間產(chǎn)物的需求[2]。此外，它還參與了腫瘤細(xì)胞增殖生長(zhǎng)、氧化應(yīng)激、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程中的多條信號(hào)通路[3]。能夠通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酰胺的主要有四種溶質(zhì)載體家族：溶質(zhì)載體家族1（solute carrier family 1, SLC1）、溶質(zhì)載體家族6（solute carrier family 6, SLC6）、溶質(zhì)載體家族7（solute carrier family 7, SLC7）、溶質(zhì)載體家族38（solute carrier family 38, SLC38）。ASCT2屬于溶質(zhì)載體家族1成員5（solute carrier family 1 member 5, SLC1A5），他是谷氨酰胺最重要的轉(zhuǎn)運(yùn)載體之一[4]。鑒于谷氨酰胺在生理和腫瘤中的重要作用，因此將谷氨酰胺的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝作為治療靶標(biāo)具有巨大的潛力[5]。但目前國內(nèi)對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)載體的相關(guān)報(bào)道較少，故本文對(duì)ASCT2的結(jié)構(gòu)、生理特性、代謝調(diào)節(jié)、腫瘤治療等方面作一綜述。

1 ASCT2的結(jié)構(gòu)與生理功能

ASCT2屬于丙氨酸-絲氨酸-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體家族，ASCT家族包括ASCT1（SLC1A4）和ASCT2（SLC1A5）[6]。ASCT2蛋白在人的肺、骨骼肌、大腸、腎臟、睪丸和脂肪組織中均有表達(dá)。人類的ASCT2是一個(gè)由541個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子質(zhì)量大約為56 598的膜蛋白，由SLC1A5基因編碼，其基因定位于人的第19號(hào)染色體q臂13.3區(qū)。ASCT2高親和力的轉(zhuǎn)運(yùn)底物有：L-Ala、L-Ser、L-Cys、L-Thr和L-Gln，ASCT2根據(jù)這些氨基酸在細(xì)胞內(nèi)的濃度梯度決定谷氨酰胺是轉(zhuǎn)入還是轉(zhuǎn)出，此外還可以轉(zhuǎn)運(yùn)一些親和力較低的中性氨基酸和谷氨酸鹽，低pH值能促進(jìn)ASCT2對(duì)谷氨酰胺的轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。結(jié)構(gòu)上，ASCT2是一個(gè)同型三聚體，其每個(gè)原體都含有一個(gè)支架區(qū)域（TMs 1，2，4，5）和一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域（TMs 3，6，7，8），以及兩個(gè)關(guān)鍵的螺旋發(fā)夾結(jié)構(gòu)域：HP1和HP2。HP2跨膜位于轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域，一端位于胞外，一端則處于細(xì)胞質(zhì)中，HP1則完全處于細(xì)胞質(zhì)中，HP1和HP2可能是ASCT2發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)功能的重要門控區(qū)域[8]。ASCT2第467位半胱氨酸決定了其只選擇中性氨基酸作為底物的特性，而第481位的絲氨酸和482位的半胱氨酸則是它區(qū)別于ASCT1，能與谷氨酰胺結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸[9]。

2 ASCT2與腫瘤

谷氨酰胺對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)非常重要，它主要由ASCT2等轉(zhuǎn)運(yùn)載體輸送到細(xì)胞中，而ASCT2在腫瘤中表達(dá)經(jīng)常上調(diào)，包括多種實(shí)體瘤與血液腫瘤，其在腫瘤中的作用已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)之一。

2.1 ASCT2與實(shí)體瘤

2.1.1 ASCT2與前列腺癌 ASCT2在正常前列腺和前列腺腫瘤中均有表達(dá)，但其在前列腺癌中異常高表達(dá) 。在前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、PC-3中添加ASCT2的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑芐基絲氨酸（benzylserine, BenSer），發(fā)現(xiàn)細(xì)胞攝取谷氨酰胺的能力顯著下降，進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白CDK1、CDC20和UBE2C的表達(dá)水平，也呈下降趨勢(shì)，表明抑制ASCT2會(huì)抑制谷氨酰胺的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng) 。谷氨酰胺還參與了mTORC1（mammalian target of rapamycin complex1）信號(hào)通路的活化，研究人員檢測(cè)了mTORC1下游分子p70S6K的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)只有在PC-3細(xì)胞中是下降的，LNCaP細(xì)胞中卻沒有這種現(xiàn)象。這說明除了mTORC1以外，還存在其他機(jī)制調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。用shRNA敲低ASCT2在PC3細(xì)胞中的表達(dá)，敲低后細(xì)胞周期阻滯且細(xì)胞活力下降。在裸鼠上建立前列腺癌移植瘤模型，接種敲低ASCT2的PC-3細(xì)胞系的小鼠腫瘤體積明顯小于對(duì)照組，且腫瘤轉(zhuǎn)移率也更低[10]。

ASCT2的表達(dá)可以被多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)，比如Rb/E2F[11]、雄激素受體3[12]和ATF4[13]等。ATF4轉(zhuǎn)錄因子的活化還與前列腺癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)，ATF4轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)在轉(zhuǎn)移后不依賴于雄激素的前列腺癌中顯著上調(diào)[12]，而敲低ASCT2卻能使早期前列腺癌肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)下降[10]。

2.1.2 ASCT2與黑色素瘤 在黑色素瘤細(xì)胞系C8161和1205Lu中用shRNA敲低ASCT2的表達(dá)，減少了谷氨酰胺和亮氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)量，從而可以抑制細(xì)胞的增殖和mTORC1的活化。用基因芯片技術(shù)分析ASCT2在正常皮膚組織和黑色素瘤中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ASCT2在黑色素瘤中的表達(dá)水平升高了4.4倍，這說明ASCT2在黑色素瘤中有重要作用[14]。ASCT2調(diào)節(jié)mTORC1的活化并非依賴谷氨酰胺本身，而是ASCT2轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酰胺入胞，當(dāng)胞內(nèi)谷氨酰胺基礎(chǔ)水平較高時(shí)，LAT1轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酰胺出胞的同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)亮氨酸入胞這一動(dòng)態(tài)過程[15]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道了另一種谷氨酰胺活化mTORC1的機(jī)制，谷氨酰胺酶可以分解谷氨酰胺形成α-酮戊二酸鹽，其參與三羧酸循環(huán)的過程也能激活RagmTORC1的信號(hào)通路，而不依賴于LAT1調(diào)節(jié)的亮氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)的過程，見圖1。

2.1.3 ASCT2與結(jié)直腸癌 ASCT2在結(jié)直腸癌中表達(dá)明顯上調(diào)，免疫組織化學(xué)分析64例結(jié)直腸癌樣本中ASCT2的表達(dá)情況，其中59%染色呈陽性，且表達(dá)水平與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[18]。統(tǒng)計(jì)分析90對(duì)樣本的結(jié)直腸癌組織和臨近的正常結(jié)直腸黏膜中ASCT2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ASCT2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)有明顯上調(diào)。隨機(jī)取出其中12對(duì)樣本進(jìn)行Western blot分析，同樣能得出ASCT2在癌組織中過表達(dá)的結(jié)論[19]。此外，ASCT2在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)水平要顯著高于黏液癌，這與此前報(bào)道的GLS1（谷氨酰胺分解過程中一種主要的酶）在腺癌而非黏液癌中過表達(dá)的結(jié)果一致，預(yù)示谷氨酰胺在腺癌中可能有不同于黏液癌的代謝途徑[19-20]。

2.1.4 ASCT2與三陰性乳腺癌 三陰性乳腺癌是雌激素受體、孕激素受體及人表皮生長(zhǎng)因子受體2均陰性的乳腺癌患者，對(duì)這種乳腺癌沒有相應(yīng)的靶向療法，只能依賴手術(shù)和放化療進(jìn)行治療，其預(yù)后也較其他類型差[21]。有文獻(xiàn)報(bào)道Basal-like型（即三陰性乳腺癌）相較于Luminal型乳腺癌，對(duì)谷氨酰胺的攝取更為敏感[22]。選擇兩株不同臨床背景的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7（Luminal型）和HCC1806（Basal-like型）進(jìn)行研究，這兩株細(xì)胞系均高表達(dá)ASCT2。用ASCT2的抑制劑GPNA處理兩株細(xì)胞，只有HCC1806細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，且mTORC1的活性降低 ，ASCT2受抑制使HCC1806發(fā)生凋亡的細(xì)胞明顯增多，而MCF-7的細(xì)胞活力不受影響。這些事實(shí)表明不同乳腺癌細(xì)胞系對(duì)ASCT2活性的依賴程度不同，只有Basal-like型的乳腺癌細(xì)胞系生長(zhǎng)需要ASCT2攝取谷氨酰胺[23]。因此，靶向ASCT2或者下游的谷氨酰胺代謝通路，可能成為治療三陰性乳腺癌的新療法[24]。

圖1 谷氨酰胺分解活化RagmTORC1信號(hào)通路[16-17]Figure1 Glutaminolysis activates mammalian TORC1 (mTORC1) via Rag[16-17]

2.2 ASCT2與血液腫瘤

在許多早期急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia, AML）的病例中，mTORC1處于活化的狀態(tài)，但其具體活化機(jī)制未知[25]。氨基酸可以調(diào)節(jié)mTORC1的活性，主要是亮氨酸[26]。將亮氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)的同時(shí)需要將谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，因此亮氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)效率取決于胞內(nèi)谷氨酰胺的濃度，而谷氨酰胺的攝取主要依賴轉(zhuǎn)運(yùn)載體ASCT2[27]，攝取谷氨酰胺入胞和隨后流出胞外交換亮氨酸入胞這一過程已成為mTORC1活化的限速步驟[15]。對(duì)所有AML細(xì)胞系進(jìn)行谷氨酰胺饑餓處理，發(fā)現(xiàn)p70S6K T389和4E-BP1 S65磷酸化水平降低，且24 h后所有細(xì)胞系都發(fā)生凋亡，其中現(xiàn)象最明顯的是MV4-11和OCI-AML3細(xì)胞，這些結(jié)果預(yù)示著谷氨酰胺的剝奪會(huì)抑制mTORC1的活化，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[28]。ASCT2在所有白血病細(xì)胞系中都有表達(dá)，抑制ASCT2的表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出抗癌活性。但完全抑制HL-60細(xì)胞中ASCT2的表達(dá)也沒有引起細(xì)胞凋亡，這可能是因?yàn)橛衅渌劝滨０忿D(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)作為補(bǔ)償，從而也能活化mTORC1[29]。

3 ASCT2與谷氨酰胺代謝的相關(guān)抑制劑

鑒于谷氨酰胺在生理和腫瘤中的重要作用，將谷氨酰胺的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝作為治療靶標(biāo)具有巨大的潛力。因此針對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)載體ASCT2和其代謝的關(guān)鍵酶谷氨酰胺酶，開發(fā)了多種抑制劑，部分抑制劑在前期研究中表現(xiàn)出良好的抗癌活性。

3.1 ASCT2的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑

Benzylserine和Benzylcysteine能通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ASCT2的底物結(jié)合位點(diǎn)，抑制ASCT2的功能。此外，這些化合物還可以抑制陰離子的電導(dǎo)率，而陰離子的電導(dǎo)性與轉(zhuǎn)運(yùn)底物的移動(dòng)有關(guān)，因此這兩個(gè)化合物能競(jìng)爭(zhēng)性地阻斷ASCT2轉(zhuǎn)運(yùn)底物的移位。由于Benzylserine和Benzylcysteine與ASCT2結(jié)合的親和力仍然偏低，意味著在生理學(xué)研究中需要使用高濃度的抑制劑，這會(huì)導(dǎo)致與其他蛋白的非特異性作用增強(qiáng)。在化合物的絲氨酸或半胱氨酸殘基上的β-碳上添加親水羥基或酰胺基可能可以提高化合物與ASCT2的親和力[30]。研究人員開發(fā)了一種與hASCT2有很強(qiáng)親和力的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑-V-9302。V-9302保守的α-氨基酸頭基與兩性離子識(shí)別位點(diǎn)形成了關(guān)鍵的相互作用，兩性離子識(shí)別位點(diǎn)也是ASCT2識(shí)別其他氨基酸及派生物的位點(diǎn)。經(jīng)軟件模擬V-9302能與hASCT2的氨基酸結(jié)合口袋兼容，且谷氨酰胺與hASCT2的結(jié)合區(qū)域與V-9302重疊?；诖耍琕-9302能特異性識(shí)別hASCT2并抑制其轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的功能，尤其是谷氨酰胺的轉(zhuǎn)運(yùn)[5]。

3.2 ASCT2的共價(jià)抑制劑

研究發(fā)現(xiàn)大鼠的ASCT2蛋白能與金屬，比如汞及其有機(jī)派生物結(jié)合，這能抑制谷氨酰胺的轉(zhuǎn)運(yùn)，這種結(jié)合可能是由于大鼠的序列中有與金屬結(jié)合的模體（CXXC）[31]。雖然人的ASCT2上沒有CXXC模體，但它的半胱氨酸殘基能與汞的派生物成鍵產(chǎn)生強(qiáng)反應(yīng)性[32-33]。第467位的半胱氨酸殘基被認(rèn)為是hASCT2的底物結(jié)合位點(diǎn)的一部分，并且與谷氨酰胺的識(shí)別和移位有關(guān)。針對(duì)ASCT2上半胱氨酸殘基開發(fā)抑制劑具有高特異性和高效力的優(yōu)勢(shì)，避免了底物類似物類抑制劑與ASCT2結(jié)合可能被濃度更高的內(nèi)源性氨基酸替換的問題[34]。

3.3 ASCT2新型靶向抑制劑-脯氨酸派生物

化合物γ-FBP是一種脯氨酸派生物，盡管脯氨酸并非ASCT2的轉(zhuǎn)運(yùn)底物，但γ-FBP具有抑制大鼠ASCT2轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，在人的一些黑色素瘤細(xì)胞系上也能抑制ASCT2轉(zhuǎn)運(yùn)底物[35]。因此，針對(duì)hASCT2亞型設(shè)計(jì)脯氨酸派生物類分子是一種開發(fā)ASCT2抑制劑的新方法。

3.4 谷氨酰胺酶抑制劑

腫瘤細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的消耗量相比正常細(xì)胞更高，這種代謝重編程常依賴于線粒體的谷氨酰胺酶的活性，它可以將谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為生物合成過程所需的關(guān)鍵前體物質(zhì)-谷氨酸鹽[36]。近年來針對(duì)這種關(guān)鍵酶設(shè)計(jì)了一些抑制劑，其中合成化合物CB-839已經(jīng)進(jìn)入治療晚期實(shí)體瘤的一期臨床試驗(yàn)，并表現(xiàn)出良好的治療潛力[37]。一方面，腫瘤細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺代謝的依賴性，使谷氨酰胺酶成為一種有潛力的抗癌靶點(diǎn)，但另一方面，谷氨酰胺酶亞細(xì)胞定位不明確，亞型較多，這可能會(huì)阻礙谷氨酰胺酶抑制劑的設(shè)計(jì)和藥物的可獲得性[35]。相關(guān)ASCT2和谷氨酰胺酶抑制劑總結(jié)，見表1。

表1 ASCT2與谷氨酰胺酶抑制劑Table1 ASCT2 and glutaminase inhibitors

4 展望

谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)載體ASCT2在多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)已經(jīng)被充分證明，體內(nèi)體外抑制ASCT2的表達(dá)都能起到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的作用，直接抑制谷氨酰胺的代謝也能得到相似結(jié)果。這主要是過表達(dá)的ASCT2增強(qiáng)了對(duì)谷氨酰胺的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而增強(qiáng)了mTORC1信號(hào)通路的活性，但其具體谷氨酰胺的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控機(jī)制未知。由于ASCT2膜蛋白的特性和谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)功能，使其成為極具潛力的腫瘤治療靶標(biāo)，但目前進(jìn)入臨床腫瘤靶向治療的抑制谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的藥物還很少。2018年6月，研究人員成功解析了hASCT2 3.85 ?分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了一些重要的結(jié)構(gòu)域如轉(zhuǎn)運(yùn)門控區(qū)域HP2，以及通過定點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)第467位半胱氨酸是hASCT2與底物的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)[8]。針對(duì)這些結(jié)構(gòu)和重要位點(diǎn)，結(jié)合分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的動(dòng)力學(xué)等手段，設(shè)計(jì)篩選ASCT2的特異性抑制劑，將成為未來開發(fā)靶向腫瘤代謝藥物的研究熱點(diǎn)之一。