溫經(jīng)湯中6種水溶性活性成分的含量測(cè)定*

路娟，柴瑞平，陳曦

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193)

溫經(jīng)湯出自《金匱要略·婦人雜病脈證并治第二十二》，全方由12味中藥組成，分別為吳茱萸、桂枝、當(dāng)歸、川芎、牡丹皮、阿膠、麥門(mén)冬、芍藥、人參、甘草、半夏、生姜和甘草[1]。臨床使用歷史悠久，療效明顯，主治婦科原發(fā)性痛經(jīng)等病[2-3]。目前，溫經(jīng)湯的化學(xué)成分分析及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定筆者還未見(jiàn)報(bào)道，僅有方中部分單味藥材的質(zhì)控研究，這對(duì)于中藥復(fù)方新藥的開(kāi)發(fā)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。尋找快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的分析方法對(duì)復(fù)方制劑的質(zhì)量控制至關(guān)重要，不僅要提升復(fù)方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，還要符合企業(yè)生產(chǎn)實(shí)際，本次研究擬對(duì)涵蓋12味中藥的中藥復(fù)方溫經(jīng)湯的含量測(cè)定方法進(jìn)行探索，以期對(duì)后續(xù)進(jìn)入實(shí)際生產(chǎn)發(fā)揮指導(dǎo)與參考意義。關(guān)于古方溫經(jīng)湯，桂皮醛、丹皮酚、甘草酸、吳茱萸堿為2015年版《中華人民人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定的桂枝、牡丹皮、甘草、吳茱萸指標(biāo)性成分[4-7]，綠原酸及隱綠原酸則是具有多種藥理活性作用的酚酸類(lèi)化合物[8-10]。本課題組前期已成功建立溫經(jīng)湯高效液相指紋圖譜，基本反映了其整體化學(xué)特征，并對(duì)綠原酸等6個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行了指認(rèn)，方法簡(jiǎn)單易行，數(shù)據(jù)清晰可信。本研究結(jié)合前期基礎(chǔ)，采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定溫經(jīng)湯中綠原酸、隱綠原酸、甘草酸、桂皮醛、丹皮酚和吳茱萸堿等6種水溶性活性成分的含量，涉及本方多種關(guān)鍵藥味，為其臨床使用的安全性及有效性提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters UPLC H-Class系統(tǒng)(含四元溶劑泵，自動(dòng)進(jìn)樣裝置，在線真空脫氣裝置，PDA檢測(cè)器，Empower2色譜工作站)、AB265-S型分析天平(十萬(wàn)分之一，瑞士METTLER公司)、2-16R臺(tái)式高速微量冷凍離心機(jī)(上海托莫斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2藥品與試劑 人參飲片購(gòu)于吉林敖東健康科技有限公司，生姜購(gòu)于北京物美超市，其余藥材飲片均購(gòu)于北京市同仁堂藥店(馬連洼店)，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所李海濤教授鑒定均為正品，符合2015版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。 綠原酸(批號(hào)：170903)、隱綠原酸(批號(hào)：171016)、甘草酸銨(批號(hào)：170603)，桂皮醛(批號(hào)：170328)，丹皮酚(批號(hào)：170421)及吳茱萸堿(批號(hào)：170524)均購(gòu)自于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。乙腈(Merck公司，色譜純)、甲酸(汕頭市西隴化工廠有限公司，分析純)、屈臣氏雙蒸水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1溫經(jīng)湯水煎液及供試品溶液的制備 參考《名方配伍分析及應(yīng)用》(人民衛(wèi)生出版社)收錄，按一兩=3 g計(jì)算，取吳茱萸9 g，當(dāng)歸6 g，川芎6 g，人參6 g，桂枝6 g，阿膠6 g，生姜6 g，牡丹皮6 g，甘草6 g，半夏6 g，麥冬9 g，加水10倍量，浸泡30 min，加熱回流提取2次，每次1 h，合并兩次濾液，搖勻后水浴濃縮至750 mL，取適量濾液，4 ℃，12 000 r·min-1離心(r=6 cm)10 min，經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得供試品溶液，置于進(jìn)樣小瓶中待測(cè)，剩余樣品密封后保存于-20 ℃環(huán)境中[11]。同法平行制備溫經(jīng)湯水煎液10批，編號(hào)S 1～S 10，供測(cè)試用，同時(shí)留樣保存于實(shí)驗(yàn)室冰箱。

2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取綠原酸、隱綠原酸、甘草酸銨、桂皮醛、丹皮酚、吳茱萸堿對(duì)照品分別置于5 mL量瓶中，加入純甲醇制備單一對(duì)照品母液；精密吸取單一對(duì)照品母液適量，置于同一量瓶中，加入純甲醇定容搖勻，配制得到含有綠原酸、隱綠原酸、甘草酸銨、桂皮醛、丹皮酚、吳茱萸堿濃度分別為150.08，150.36，344.08，16.83，51.06，40.74 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液(其中：甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨質(zhì)量/1.0207)。

2.3陰性對(duì)照溶液的制備 按照“2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法分別制備缺吳茱萸、缺甘草、缺桂枝、缺牡丹皮的陰性樣品及缺吳茱萸、甘草、桂枝、牡丹皮的陰性樣品溶液，處理方法不變。

2.4色譜條件 Waters Xselect HSS T3色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～25 min，5%～22% A，25～35 min，22%～30% A，35～45 min，30%～60% A，45～60 min，60%～80% A)，平衡色譜柱15 min，流速0.8 mL·min-1，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為：綠原酸327 nm、隱綠原酸327 nm、甘草酸(銨)237 nm、桂皮醛290 nm、丹皮酚274 nm、吳茱萸堿225 nm。分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品和陰性對(duì)照溶液各10 μL，進(jìn)液相色譜儀進(jìn)行分析，記錄色譜圖。樣品中綠原酸等6種水溶性成分的色譜峰達(dá)到較為理想的分離效果，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。對(duì)照品、樣品及陰性樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

2.5線性關(guān)系考察 將“2.2”項(xiàng)得到的混合對(duì)照品溶液梯度稀釋為一系列不同濃度的混合對(duì)照品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。綠原酸、隱綠原酸、甘草酸銨、桂皮醛、丹皮酚、吳茱萸堿對(duì)照品回歸方程、峰面積與濃度相關(guān)系數(shù)(r)及線性濃度范圍見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，各個(gè)成分在各自范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密吸取S1批溫經(jīng)湯樣品 5份，按“2.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得綠原酸、隱綠原酸、甘草酸、桂皮醛、丹皮酚和吳茱萸堿各成分峰面積的RSD分別為0.44%，0.56%，0.32%，0.51%，1.02%，0.88%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液，按“2.4”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得綠原酸、隱綠原酸、甘草酸、桂皮醛、丹皮酚和吳茱萸堿各成分峰面積的RSD分別為0.31%，0.15%，0.22%，0.60%，0.18%，0.77%，表明儀器精密度良好，符合要求。

2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一溫經(jīng)湯樣品溶液，在室溫下放置，分別于0，2，4，8，12，24 h按“2.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得綠原酸、隱綠原酸、甘草酸、桂皮醛、丹皮酚和吳茱萸堿各成分峰面積的RSD分別為0.35%，0.29%，0.30%，0.48%，0.35%，1.11%，表明樣品溶液中6種水溶性成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知綠原酸、隱綠原酸、甘草酸、桂皮醛、丹皮酚、吳茱萸堿含量的溫經(jīng)湯樣品6份，每份2.5 mL，精密加入綠原酸、隱綠原酸、甘草酸銨(其中：甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨重量/1.0207)、桂皮醛、丹皮酚、吳茱萸堿對(duì)照品適量，制得供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2，表明該方法準(zhǔn)確度良好，符合技術(shù)要求。

A.混合對(duì)照品； B.溫經(jīng)湯水煎液；C.缺甘草陰性樣品溶液；D.缺牡丹皮陰性樣品溶液；E.缺吳茱萸陰性樣品溶液；F.缺桂枝陰性樣品溶液；G.同時(shí)缺以上4味藥材的陰性樣品溶液；1.綠原酸；2.隱綠原酸；3.甘草酸銨；4.桂皮醛；5.丹皮酚；6.吳茱萸堿

圖1254nm波長(zhǎng)下溫經(jīng)湯HPLC色譜圖

A.mixed reference substances； B.Wenjingdecoction； C.negative sample withoutGlycyrrhizaeRadix；D.negative sample withoutMoutanCortex； E.negative sample withoutEvodiaeFructus；F.negative sample withoutCinnamomiRamulus；G. Negative sample withoutGlycyrrhizaeRadix，MoutanCortex，EvodiaeFructusandCinnamomiRamulus；1.chlorogenic acid；2.cryptochlorogenic acid；3.glycyrrhizic acid；4.cinnamaldehyde；5.paeonol；6.evodiamine

Fig.1HPLCchromatogramofWenjingdecoctionat254nm

表1溫經(jīng)湯6種水溶性成分回歸方程、峰面積與濃度相關(guān)系數(shù)及線性范圍

Tab.1Regressionequation,correlationcoefficientofpeakareaandconcentration,andlinearrangeofsixwater-solubleactiveingredientsfromWenjingdecoction

成分回歸方程r線性范圍/(μg·mL-1)綠原酸Y=36 951X-56 0420.999 930.02～150.08隱綠原酸Y=33 891X-63 8140.999 830.07～150.36甘草酸銨Y=6 095.4X-31 7140.999 668.82～344.08桂皮醛Y=127 235X-70 3420.999 910.10～50.50丹皮酚Y=64 516X-72 0630.999 510.21～51.06吳茱萸堿Y=27 244X-4 7070.999 510.18～50.90

表2溫經(jīng)湯6種水溶性成分加樣回收率實(shí)驗(yàn)

Tab.2Recoveryofsixwater-solubleactiveingredientsfromWenjingdecoctionn=6

成分原有量加入量測(cè)得量mg平均回收率RSD%綠原酸0.130.150.2999.981.04隱綠原酸0.130.150.28100.511.23甘草酸0.650.691.34100.070.75桂皮醛0.040.050.10103.111.31丹皮酚0.060.060.1297.891.74吳茱萸堿0.030.030.0698.062.11

2.10樣品含量測(cè)定 取溫經(jīng)湯樣品溶液平行5份，按“2.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)得的峰面積分別代入“2.5”項(xiàng)下的回歸方程，計(jì)算樣品中綠原酸、隱綠原酸、甘草酸、桂皮醛、丹皮酚和吳茱萸堿的含量，(其中：甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207)。見(jiàn)表3。

表3溫經(jīng)湯6種水溶性成分的含量

Tab.3Contentsofsixwater-solubleactiveingredientsfromWenjingdecoctionn=5

成分含量平均值/(mg·g-1)RSD/%綠原酸0.540.56隱綠原酸0.540.61甘草酸2.631.12桂皮醛0.140.52丹皮酚0.252.10吳茱萸堿0.091.88

3 討論

本研究根據(jù)課題組前期建立的溫經(jīng)湯高效液相指紋圖譜為參考，采用全波長(zhǎng)掃描的方法對(duì)樣品及對(duì)照品在210～400 nm下進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)綠原酸、隱綠原酸在327 nm處有最大吸收，甘草酸銨在237 nm處有最大吸收，桂皮醛在290 nm處有最大吸收，丹皮酚在274 nm處有最大吸收，吳茱萸堿在225 nm處有最大吸收，因此分別在各個(gè)成分最大吸收波長(zhǎng)下進(jìn)行含量測(cè)定。

筆者考察了不同規(guī)格的色譜柱對(duì)成分分離的影響，分別為Waters XBridge Shield RP18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Waters XBridge BEH Amide(4.6 mm×250 mm，5 μm)和Waters Xselect HSS T3色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用Waters Xselect HSS T3色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)時(shí)峰形對(duì)稱(chēng)，分離度符合要求[12]；通過(guò)考察常用流動(dòng)相甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液等條件[13-14]，其中乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)供試品溶液色譜峰分離度等指標(biāo)均優(yōu)于其他，最終確定其為流動(dòng)相，采用梯度洗脫的方法對(duì)供試品進(jìn)行分析。古代經(jīng)典名方是中藥新藥開(kāi)發(fā)重要寶庫(kù)，挖掘前人寶貴經(jīng)驗(yàn)，全面開(kāi)發(fā)中藥新藥，提升質(zhì)量與療效的工作刻不容緩。本研究建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定溫經(jīng)湯中6種水溶性成分含量測(cè)定的方法，該方法簡(jiǎn)單易行、準(zhǔn)確真實(shí)，穩(wěn)定可靠，為古代經(jīng)典名方開(kāi)發(fā)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了參考[15-17]。