沒(méi)食子提取物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的治療作用*

美熱古麗·依米提，曹春雨，2，竇勤，李治建，斯拉甫·艾白

(1.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，烏魯木齊 830049；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種臨床常見(jiàn)且原因不明的炎性疾病，又稱非特異性潰瘍性結(jié)腸炎，主要累及到直腸和乙狀結(jié)腸，病理表現(xiàn)主要是結(jié)腸黏膜和黏膜下層的慢性炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、隱窩膿腫以及腺體和上皮的損傷為主要特征[1]。臨床上常以腹瀉、黏液膿血便、里急后重和腹痛為主要癥狀，除此外還有發(fā)熱、體質(zhì)量下降、貧血、關(guān)節(jié)疼痛、皮膚黏膜損傷、腎結(jié)石和骨質(zhì)疏松等多種臨床表現(xiàn)[2]。沒(méi)食子是沒(méi)食子蜂科昆蟲(chóng)沒(méi)食子蜂(Cynips gallae-tinctorice Oliv)的幼蟲(chóng)，寄生于殼斗科植物沒(méi)食子樹(shù)(Quercus infectoria Oliv.)幼枝上所產(chǎn)成的蟲(chóng)癭，是維吾爾醫(yī)常用藥材，具有清除異常體液的作用，臨床用于治療潰瘍性結(jié)腸炎，具有斂腸、消炎止瀉、開(kāi)通腸阻、促使?jié)冇系淖饔?，療效顯著，但其治療UC的作用機(jī)制尚未明確。在UC患者中，白細(xì)胞介素-6(IL-6)濃度均明顯高于非病變部位[3-9]，IL-6通過(guò)激活雅努斯激酶(Janus kinase，JAK)蛋白，間接地導(dǎo)致STAT3高表達(dá)，加速潰瘍癌變[10-15]，JAK抑制劑可在一定程度上緩解UC炎癥反應(yīng)。筆者通過(guò)研究沒(méi)食子提取物對(duì)上述炎癥遞質(zhì)及相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討其抗UC的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(新)2016-0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)環(huán)境：新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所SPF級(jí)動(dòng)物房。飼養(yǎng)在塑料籠內(nèi)，每籠飼養(yǎng)性動(dòng)物不多于5只，自由飲水。相對(duì)濕度：40%～70%，室溫：20～26 ℃，光照12 h，實(shí)驗(yàn)正式開(kāi)始前經(jīng)檢疫和適應(yīng)性飼養(yǎng)，選擇健康動(dòng)物進(jìn)行造模。

1.2試劑和藥品 沒(méi)食子提取物，沒(méi)食子藥材(批號(hào)：20161112)購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院，新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所藥劑科希爾艾力·吐?tīng)栠d研究員鑒定為正品。提取方法：取沒(méi)食子，粉碎成粗粉，加8倍量水浸泡1 h后煎煮3次，每次0.5 h，合并煎液，濾過(guò)，濾液真空干燥得浸膏，稱質(zhì)量，計(jì)算得率為75%。大鼠IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：230671122)；大鼠JAK ELISA試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司，批號(hào)：GR201801-1)；DEPC水(上海生工生物工程有限公司，批號(hào)：D424BA005)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司，批號(hào)：00374923)；PCR Master MIX(Thermo公司，批號(hào)：1706549)；Stat3、IL-6、β-actin(上海生工生物工程有限公司)；三氯甲烷、異丙醇、無(wú)水乙醇均為分析純。

1.3主要儀器 自動(dòng)血液分析儀(Thermo公司)；MuitiskanGo型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Thermo公司)；QGARD00R1型超純水純化系統(tǒng)(Q-Gard 公司)；WH-25型恒溫培養(yǎng)箱(WIGGENS公司)；C1000 touch型PCR儀(Thermo公司)；CFX96型熒光定量PCR儀(Thermo公司)；ND1000型核酸蛋白測(cè)定儀(美國(guó)NanoDrop公司)；QGARD00R1超純水純化系統(tǒng)(Q-Gard公司，Lot：F4DA29061)；SC-3610型離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分工公司)；ND1000型核酸蛋白測(cè)定儀(美國(guó)NanoDrop公司)。

1.4造模與分組 取健康SPF雄性SD大鼠80只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量采用分層法隨機(jī)抽取16只為正常對(duì)照組，剩下的64只，采用2，4，6三硝基甲苯磺酸(TNBS)一次性局部灌腸制備UC大鼠模型。造模過(guò)程：將動(dòng)物禁食12 h后，采用0.5%戊巴比妥鈉 0.5 mL·(100 g)-1腹腔注射麻醉，將由肛門(mén)輕緩插一直徑2.7 mm長(zhǎng)約37 cm的橡膠導(dǎo)尿管入直腸深在6～8 cm處注入制備好的造模液，注入造模液后大鼠倒置30 s ，每只0.5 mL·(100 g)-1，讓動(dòng)物保持俯臥位自然醒的狀態(tài)[16-21]。造模后觀察一般情況，包括飲食、體質(zhì)量、皮毛、大小便、活動(dòng)情況、精神狀態(tài)等并作觀察。造模標(biāo)準(zhǔn)采用參考文獻(xiàn)公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，造?？陕匝装Y性腸疾(inflammatory bowel disease，IBD)造模后1～3 d出現(xiàn)稀便或膿血便，解剖可見(jiàn)結(jié)腸部位潰瘍性病變視為模型成功，并伴有精神萎靡、毛發(fā)色澤暗淡、活動(dòng)減少，反應(yīng)變慢等全身改變[17-21]。造模成功后，分為模型對(duì)照組、美沙拉嗪組(美沙拉嗪150 mg·kg-1)，沒(méi)食子提取物小劑量組(150 mg·kg-1)、沒(méi)食子提取物大劑量組(300 mg·kg-1)，每組16只。給藥體積為1 mL·(100 g)-1，每天一次，連續(xù)2周。給藥結(jié)束后，腹主動(dòng)脈取血，取距肛門(mén)8～10 cm的結(jié)腸作病理檢查。

1.5血清IL-6、JAK的測(cè)定 IL-6的檢測(cè)：嚴(yán)格按照IL-6 ELISA說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。JAK的檢測(cè)：嚴(yán)格按照J(rèn)AK蛋白ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.6RT- PCR法檢測(cè)IL-6、STAT3 mRNA的表達(dá)

1.6.1RNA提取 組織標(biāo)本放入液氮中充分研磨至粉末，研磨后置于EP管中加Trizol 1 mL，混勻，室溫放置5 min，加入0.2 mL的三氯甲烷劇烈搖蕩15 s，室溫靜置5 min；4 ℃12 000 r·min-1，10 min，取上層水相于一新的EP管中，加入異丙醇0.5 mL，室溫放置10 min，12 000 r·min-1，10 min離心，棄去上清液；加入75%乙醇1 mL清洗。4 ℃、12 000 r·min-1，離心5 min后棄去上清，重復(fù)操作一次；棄去上清液，室溫或真空干燥5～10 min；加量DEPC水溶解RNA(30 μL)，取RNA 1 μL進(jìn)行定量純度的鑒定，合格后進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.6.2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 核酸定量?jī)x測(cè)定RNA濃度，取RNA 總量1 μg，配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：將Oligo dT 1 μL、dNTP 2 μL、ReverAid 1 μL、RNA inhibitor 1 μL、5×Buffer 4 μL、RNA和ddH2O 共11 μL加入無(wú)Rnase的PCR管中，42 ℃加熱60 min，再70 ℃ 5 min后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系20 μL：包括dd H2O 8 μL、2×Master Mix 10 μL、上下游引物1 μL及cDNA 1 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃，15 s，60 ℃退火延伸30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。目標(biāo)引物序列和內(nèi)參引物序列見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1沒(méi)食子提取物對(duì)UC大鼠血清IL-6和JAK含量的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組 IL-6水平和JAK蛋白含量均升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，美沙拉嗪組、沒(méi)食子提取物小、大劑量組IL-6 水平和JAK蛋白含量降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 目標(biāo)引物序列和內(nèi)參引物序列

表25組UC大鼠血清IL-6和JAK含量的比較

Tab.2ComparisonofIL-6levelandJAKcontentinserumamongfivegroupsofUCrats

組別IL-6(n=16)JAK(n=8)正常對(duì)照組121.00±30.36?11038.02±270.01模型對(duì)照組232.00±20.481488.24±181.29?1美沙拉嗪組162.10±5.11?21220.94±116.22?2沒(méi)食子提取物 小劑量組157.66±9.53?21427.70±207.71 大劑量組144.85±10.09?21238.01±83.09?2

與正常對(duì)照組比較，*1P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05

2.2沒(méi)食子提取物對(duì)UC大鼠潰瘍組織IL-6、STAT3基因的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組IL-6、STAT3基因表達(dá)升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，美沙拉嗪組、沒(méi)食子提取物大劑量組IL-6表達(dá)降低；美沙拉嗪組和沒(méi)食子提取物小、大劑量組STAT3表達(dá)均降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

3 討論

三硝基苯磺酸所誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型因其比較接近于人類又有較好的重復(fù)性而被普遍使用，是目前研究的一個(gè)重要模型[22]。三硝基苯磺酸作為一種半抗原物質(zhì)，與結(jié)腸膜組織中的大分子組織蛋白結(jié)合，形成一種完全抗原，進(jìn)一步引起機(jī)體異常的免疫反應(yīng)從而誘導(dǎo)腸炎的發(fā)生。其致病機(jī)制為損傷上皮屏障后由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)其疾病的發(fā)展且病理及組織學(xué)改變均類似于人類炎癥性腸病。在UC患者病變結(jié)腸組織中，IL-6濃度均明顯高于非病變部位[3-9]，IL-6通過(guò)激活JAK蛋白，間接地導(dǎo)致STAT3高表達(dá)，加速潰瘍癌變[10-15]。STAT3是在UC中起重要作用，研究顯示，STAT3的激活在特異性和非特異性免疫中起明顯不同的作用，它與致病及炎癥程度相關(guān)[23-27]。細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖和免疫調(diào)節(jié)等多個(gè)關(guān)鍵的生物過(guò)程都有JAK/STAT信號(hào)通路在參與[28-30]。JAK/STAT信號(hào)通路還與UC等多種疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。IL-6細(xì)胞因子刺激信號(hào)可誘導(dǎo)激活JAK/STAT信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，引發(fā)相關(guān)細(xì)胞反應(yīng)。JAK在炎癥失調(diào)中發(fā)揮重要作用，JAK抑制劑可在一定程度上緩解UC炎癥反應(yīng)。而高表達(dá)的IL-6，可激活JAK蛋白，增加STAT3表達(dá)[31]。研究結(jié)果顯示，沒(méi)食子提取物能抑制IL-6的分泌。說(shuō)明沒(méi)食子提取物能有效的提高單核/巨噬細(xì)胞功能，減少致炎因子的釋放。除了炎癥反應(yīng)中對(duì)促炎遞質(zhì)的分泌具有抑制的作用，還對(duì)機(jī)體正常免疫防御功能中又有促進(jìn)作用、發(fā)揮其雙向調(diào)節(jié)功能。

表35組UC大鼠結(jié)腸組織IL-6、STAT3mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

Tab.3ComparisonoftherelativemRNAexpressionofIL-6andSTAT3incolonsamongfivegroupsofUCrats

組別IL-6STAT3正常對(duì)照組1.56±0.560.79±0.24模型對(duì)照組11.13±14.83?16.07±1.25?1美沙拉嗪組4.70±3.62?22.17±0.69?2沒(méi)食子提取物 小劑量組9.73±6.244.57±1.18?2 大劑量組5.60±2.20?22.56±1.83?2

與正常對(duì)照組比較，*1P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05

JAK是一類重要的酪氨酸蛋白激酶(PTK)，JAK2 是 JAK 家族中一個(gè)重要成員[32]；STAT(signal transducer and activators of transcription)是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子的簡(jiǎn)稱，是一類既具有信號(hào)傳導(dǎo)功能又有轉(zhuǎn)錄活化癌基因編碼功能的細(xì)胞質(zhì)蛋白，可以被許多肽類蛋白如生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子激活[33]。JAK/STAT信號(hào)通路在潰瘍到癌癥的疾病的發(fā)展及研究中已成為腫瘤治療的靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)多種人類腫瘤如結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等存在異?；罨癄顟B(tài)的STAT3。IL-6 等細(xì)胞因子與其特異性受體結(jié)合后，JAK2 通過(guò) FERM 結(jié)構(gòu)域與受體相結(jié)合并被磷酸化激活，磷酸化的 JAK2 使 STAT3 被磷酸化而活化，活化的 STAT3 形成二聚體并暴露其核定位信號(hào)，從而由胞漿轉(zhuǎn)移到胞核，與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子協(xié)同調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、存活、凋亡和血管生成等生理過(guò)程。STAT3的激活在人體主要的惡性腫瘤細(xì)胞中具有持續(xù)高表達(dá)的特點(diǎn)，持續(xù)激活的STAT3可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞無(wú)限制生長(zhǎng)、抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡、刺激腫瘤組織內(nèi)部血管的生長(zhǎng)等，這些變化都會(huì)加重腫瘤患者的病情。本研究表明，沒(méi)食子提取物能抑制IL-6、STAT3的逆轉(zhuǎn)錄水平，也能有效抑制IL-6促炎細(xì)胞因子的分泌。RT-PCR分析結(jié)果可得，沒(méi)食子提取物也能有效抑制IL-6、STAT3的逆轉(zhuǎn)錄水平。提示沒(méi)食子提取物能有效抑制巨噬細(xì)胞功能，減少巨噬細(xì)胞致炎細(xì)胞因子IL-6等的釋放，阻斷JAK2/ STAT3通路的異常磷酸化，達(dá)到抑制炎癥加重的目的。本研究證實(shí)沒(méi)食子提取物對(duì)促炎介質(zhì)有抑制作用，可通過(guò)降低UC大鼠模型血清IL-6、JAK水平及其潰瘍組織IL-6、STAT3基因表達(dá)發(fā)揮抗UC作用。