喉痹中藥組方規(guī)律探索及整合藥理學(xué)分子機(jī)制*

楊相立，韋升利，王林，董林毅，趙振營，劉吉祥

(1.天津市人民醫(yī)院耳鼻喉科，天津 300121；2.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津 300070；3.天津市人民醫(yī)院藥學(xué)部，天津 300121)

中醫(yī)概念的喉痹在廣義上是咽喉病的總稱，在狹義上專指咽炎。喉痹的產(chǎn)生原因以肺胃為主，與五臟六腑有關(guān)；熱邪火邪侵害為主，陰虛血虛為次。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為的咽喉疾病是以喉部腫脹疼痛呼吸閉阻不適為主要表現(xiàn)，通常認(rèn)為口腔咽喉部位存在著各種致病菌，例如有溶血性鏈球菌等，與體內(nèi)的其他微生物群落形成動態(tài)平衡。隨著人體內(nèi)部小環(huán)境改變，例如身體對疾病的抵抗能力下降、因各種原因過多過度用嗓時，原有的微生物群落的天然平衡就會出現(xiàn)混亂，有害的致病菌快速大量地異常繁殖造成嚴(yán)重感染。從而在咽喉或鄰近部位出現(xiàn)典型的干、痛、腫等癥狀，廣泛炎癥容易出現(xiàn)在咽部黏膜、黏膜下組織及淋巴組織等部位。中西醫(yī)對咽喉疾病的病因認(rèn)知的迥異導(dǎo)致采取的治療方式的不同，臨床治愈率存在差異。筆者運(yùn)用中醫(yī)方劑數(shù)據(jù)挖掘軟件研究喉痹中藥組方的規(guī)律，并通過整合藥理學(xué)平臺建立咽喉疾病分子機(jī)制層面的傳統(tǒng)中醫(yī)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)之間的過渡橋梁，深化了中西醫(yī)在咽喉疾病領(lǐng)域的探索和認(rèn)知，以進(jìn)一步提高臨床咽喉疾病的治愈率。

1 數(shù)據(jù)與方法

1.1數(shù)據(jù)來源

1.1.1處方來源與篩選 《中藥成方制劑》是中藥成方制劑的國家標(biāo)準(zhǔn)，將4000余種中成藥匯編成21冊，來源可靠明確、質(zhì)量和安全有確切保障，具有較高的代表性和權(quán)威性，因而本研究將其所收集的組方作為數(shù)據(jù)分析來源。喉痹主要癥狀以中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)為評判標(biāo)準(zhǔn)[1]。經(jīng)軟件分析后，符合條件的治療喉痹處方組成共177 首。本研究所用的組方分析的“中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)(V2.5)”工具，開發(fā)商是中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所。將篩選后的處方標(biāo)準(zhǔn)化導(dǎo)入輔助系統(tǒng)，數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性由雙人負(fù)責(zé)審核。

1.1.2數(shù)據(jù)分析 在中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)《中藥成方制劑》數(shù)據(jù)庫中提取出“中醫(yī)疾病”以“喉痹”為關(guān)鍵字的相關(guān)的全部方劑。依據(jù)降序排列的順序?qū)⒎絼┲薪M成中藥進(jìn)行頻次排序，并導(dǎo)出結(jié)果。

1.1.3組方規(guī)律分析 將“支持度個數(shù)”定義為在所有藥物中同時出現(xiàn)的次數(shù)，按照經(jīng)驗(yàn)及分析需要設(shè)為17，“置信度”設(shè)為0.6，按藥物組合出現(xiàn)頻次降序順序進(jìn)行排序“規(guī)則分析”分析所得的規(guī)則。

1.1.4新方分析 選擇合適的相關(guān)度和懲罰度，運(yùn)用改進(jìn)的互信息法和復(fù)雜系統(tǒng)熵聚類等核心算法進(jìn)行聚類分析，運(yùn)用無監(jiān)督的熵層次的聚類的基本算法進(jìn)行提取組合后發(fā)現(xiàn)新組方，通過網(wǎng)絡(luò)可視化直觀展示。

1.1.5化學(xué)成分來源 在整合藥理學(xué)平臺信息設(shè)定頁面，以中醫(yī)傳承平臺篩選出的新方中藥組成，建立化學(xué)成分庫。

1.1.6候選靶標(biāo)來源 在整合藥理學(xué)平臺的信息設(shè)定界面，以“Iaryngopharyngitis”作為疾病或癥狀關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，手工建立DRUGBANK對應(yīng)的疾病靶標(biāo)。在中藥靶標(biāo)預(yù)測界面導(dǎo)入所獲得的化學(xué)成分庫，候選成分預(yù)測靶標(biāo)要求相似性分?jǐn)?shù)>0.9。

1.2方法

1.2.1中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng) 本軟件開發(fā)商是中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，在軟件中采用了先進(jìn)的數(shù)據(jù)挖掘方法，例如：規(guī)則分析、改進(jìn)的互信息法、復(fù)雜系統(tǒng)熵聚類、無監(jiān)督的熵層次聚類等，具有一體化的“錄入-管理-查詢-分析-網(wǎng)絡(luò)可視化展示”等數(shù)據(jù)處理能力，一站式完成病案、疾病、證候、中藥、方劑、四診等信息的管理、查詢、綜合分析等功能，主要用于方劑組方規(guī)律分析及新藥處方發(fā)現(xiàn)等研究[2]。

1.2.2整合藥理學(xué)平臺 整合平臺以多學(xué)科邊緣交叉、融合為基礎(chǔ)，以大數(shù)據(jù)庫為依托，采用人工智能、數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)計算科學(xué)等方法和技術(shù)，運(yùn)用系統(tǒng)工程的方法[3]，融合“整體與局部”“體內(nèi)藥物動力學(xué)過程與活性評價”“體外與體內(nèi)”等多層次、多環(huán)節(jié)的綜合性研究，構(gòu)造了傳統(tǒng)中醫(yī)與現(xiàn)代科技之間過渡橋梁[4]。

1.3數(shù)據(jù)分析

1.3.1喉痹治療方劑用藥規(guī)律分析 對于已建立的喉痹中醫(yī)方劑庫，通過集成規(guī)則分析、互信息法等數(shù)據(jù)挖掘方法，相繼開展了頻次統(tǒng)計分析、組方規(guī)律分析和新方分析等深入計算，篩選出合適的新方。

1.3.2核心組合對分子機(jī)制研究 應(yīng)用整合藥理學(xué)平臺靶標(biāo)預(yù)測、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等功能，進(jìn)行分析及可視化工作。構(gòu)建篩選新方的成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，及新方-喉痹相關(guān)靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，并對篩選新方所作用的喉痹相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行功能分析及通路分析對比。

1.3.3新方確定 排除程序篩選出的有毒中藥和臨床不常用的中藥，確定合適的新方。

2 結(jié)果與分析

2.1用藥頻次統(tǒng)計 對方劑數(shù)據(jù)庫治療喉痹的處方中的藥物頻次進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)使用頻次高于20的共有17 味藥，位居使用頻次前5 位的分別是甘草、冰片、黃芩、大黃、玄參。在高頻藥物中，甘草補(bǔ)脾益氣，清熱解毒。冰片味辛苦，性溫?zé)o毒，主治喉閉乳蛾。黃芩味苦平，大寒無毒，主治諸熱，可以針對胃熱導(dǎo)致的咽喉腫痛。大黃味苦寒，除痰實(shí)，滌蕩腸胃間熱，適用于痰、腸熱導(dǎo)致的咽喉腫痛。玄參味苦咸，主腹中寒熱積聚。見表1。

表1使用頻次>20次的中草藥情況

Tab.1Chineseherbswithusagefrequencymorethan20

中藥名稱頻率甘草54冰片52黃芩47大黃35玄參35薄荷31桔梗31牛黃31麥冬29金銀花29中藥名稱頻率連翹25梔子25板藍(lán)根23生地黃23青黛21珍珠20硼砂20

2.2組方規(guī)律分析 分析所得藥對及藥組的用藥規(guī)則，按照藥物組合出現(xiàn)頻次由高到低排序，前5位分別是“黃芩，大黃”(27)、“冰片，牛黃”(27)、“甘草，薄荷”(25)、“玄參，甘草”(24)、“麥冬，玄參”(24)。 “黃芩，大黃”合用可運(yùn)用大黃苦寒走里，通便瀉熱以解毒，熱從下瀉，黃芩苦寒走表，清表瀉火。二藥合用，相輔相成，表里雙解，實(shí)熱自除；“冰片，牛黃”合用既可清熱瀉火、止痛的功效；“甘草，薄荷” 合用可發(fā)汗解表，散熱疏風(fēng)；“玄參，甘草”合用可生津滋陰、止咳發(fā)熱；“麥冬，玄參”合用可利咽滋陰、止渴潤燥。高頻出現(xiàn)的藥對具有緩解喉痹的臨床癥狀的作用，對發(fā)熱、上火、疼痛的喉痹癥狀等均有明確的療效。見表2。

表2處方中支持度為70%條件下中草藥組合頻次

Tab.2Chineseherbcombinationfrequencyinprescriptionswithsupportdegreeof70%

序號藥物模式出現(xiàn)頻度1黃芩,梔子182黃芩,甘草203黃芩,大黃274黃芩,桔梗195梔子,甘草176玄參,甘草247麥冬,玄參248生地黃,玄參209甘草,薄荷2510甘草,大黃19序號藥物模式出現(xiàn)頻度11甘草,桔梗1912冰片,甘草2313麥冬,甘草1814生地黃,甘草1915冰片,青黛1816冰片,珍珠1817冰片,牛黃2718麥冬,生地黃1719麥冬,玄參,甘草1720麥冬,生地黃,玄參17

2.3新方分析 運(yùn)用進(jìn)行藥物間的關(guān)聯(lián)度分析，結(jié)合基于無監(jiān)督熵層次聚類和基于熵層次聚類等算法，獲得治療喉痹5個新處方(表3)。通過 “網(wǎng)絡(luò)展示功能”直觀地展示出藥物不同組合之間的關(guān)系，得到治療喉痹新處方的網(wǎng)絡(luò)可視化展示(圖1)。排除新方組成篩選出的礦物類、毒性類中藥雄黃、蟾酥以及不常用的中藥，以及考慮與整合藥理學(xué)平臺聯(lián)用的一致性，通過中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)挖掘得到的合適的新方組成為“麥冬_生地黃_川貝母_牡丹皮_梔子_黃芩_黃柏_大黃”。新方組成中，麥冬生津解渴、潤肺止咳；生地黃清熱涼血、養(yǎng)陰生津；川貝母潤肺化痰；牡丹皮清熱涼血、消炎鎮(zhèn)痛、活血化瘀；梔子瀉火除煩、清熱利濕、清肝明目、消腫止痛；黃芩清熱燥濕、瀉火解毒；黃柏清熱燥濕、瀉火解毒；大黃利濕退黃、瀉熱通便。

表3基于熵層次聚類的治療喉痹新處方

Tab.3Newprescriptionsforpharyngitistreatmentbasedonhierarchicalclusteringentropy

序列號新方組合0滑石-羌活-牽牛子-千里光-決明子1珍珠-青黛-冰片-雄黃-麝香-蟾酥2青黛-硼砂-冰片-珍珠-牛黃-蟾酥3野菊花-崗梅-魚腥草-山芝麻-金盞銀盤4麥冬-生地黃-川貝母-牡丹皮-梔子-黃芩-黃柏-大黃

2.4整合藥理學(xué)平臺分析

2.4.1化學(xué)成分統(tǒng)計分析 新方中麥冬共收集化學(xué)成分53個，主要化學(xué)成分為含多種甾體皂苷，如麥門冬皂苷；含黃酮類多為髙異黃酮類；含揮發(fā)油、微量元素、谷甾醇、豆甾醇等[5]。生地黃共收集化學(xué)成分38個，主要化學(xué)成分為糠醛、酪醇、紫羅蘭酮、阿魏酰基筋骨草醇、麥角甾苷、地黃苷、異地黃苷等[6]。川貝母共收集化學(xué)成分21個，主要化學(xué)成分為異甾類生物堿和生物堿，生物堿成分有川貝堿、西貝素[7]。牡丹皮共收集化學(xué)成分15個，主要化學(xué)成分單萜及其苷類、酚及酚苷類、三萜及其苷類和揮發(fā)油類等成分[8]。梔子共收集化學(xué)成分48個，主要化學(xué)成分為環(huán)烯醚萜類化合物，同時還存在有機(jī)酸、黃酮、香豆素、揮發(fā)油、皂苷、木脂素、多糖及其他類化合物等[9]。黃芩共收集化學(xué)成分54個，主要化學(xué)成分為黃酮及其苷類、萜類化合物及揮發(fā)油等成分等[10]。黃柏共收集化學(xué)成分24個，主要化學(xué)成分為含有生物堿類、檸檬苷素類、留醇類、酯類、萜類、揮發(fā)性成分類及微量元素類等有效成分，特征化學(xué)成分為鹽酸小檗堿[11]。大黃共收集化學(xué)成分88個，主要化學(xué)成分有蒽醌及其苷類、蒽酮及其苷類、二苯乙烯類、多糖類、鞣質(zhì)類等[12]。

圖1 治療喉痹新處方( 相關(guān)度5，懲罰系數(shù)2)

2.4.2新方組合對治療喉痹的核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)分析 通過整合藥理學(xué)平臺可獲得新方靶標(biāo)功能基因本體(gene ontology，GO)富集分析和通路KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析，以及分別構(gòu)建基于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)數(shù)據(jù)庫的新方組合核心對作用的潛在靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)之間相互作用網(wǎng)絡(luò)。系統(tǒng)設(shè)定根據(jù)Degree值，圖2僅顯示前100個靶點(diǎn)，圖中節(jié)點(diǎn)大小與Degree值正相關(guān)。在整合藥理學(xué)平臺上可獲得新方靶標(biāo)功能GO富集分析和通路KEGG富集分析，同時構(gòu)建基于PPI相互作用數(shù)據(jù)庫的新方組合核心對作用的潛在靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)之間相互作用網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)條件篩選出新方組合關(guān)鍵靶標(biāo)630個，其中化學(xué)成分潛在作用節(jié)點(diǎn)358個，沒有直接作用的節(jié)點(diǎn)，表明新方的化學(xué)成分是通過間接影響發(fā)揮的作用。

2.4.3通路富集分析 運(yùn)用平臺的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析功能進(jìn)行新方中心蛋白質(zhì)(Hub)節(jié)點(diǎn)及其通路、功能富集分析、通路富集分析并進(jìn)行對比。見表4，5。

圖2新方中藥方劑調(diào)節(jié)疾病失衡網(wǎng)絡(luò)的候選靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

Fig.2CandidatetargetnetworkforregulatingdiseaseimbalancenetworkbynewprescriptionoftraditionalChineseMedicine

表4 新方治療疾病關(guān)鍵靶標(biāo)具有的功能信息列表對比

表5 新方治療疾病關(guān)鍵靶標(biāo)所參與的通路信息列表對比

2.4.4靶標(biāo)分析 運(yùn)用平臺的關(guān)鍵靶標(biāo)分析功能分別進(jìn)行新方核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)可視化分析、關(guān)鍵靶標(biāo)功能富集分析、關(guān)鍵靶標(biāo)的通路富集分析、中藥-成分-關(guān)鍵藥靶-通路網(wǎng)絡(luò)可視化分析。見圖3。

圖3新方中藥方劑治療疾病“核心成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-主要通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

Fig.3Multi-dimensionalnetworkdiagramof"corecomponent-keytargets-mainpathways"ofthenewprescriptionsfordiseasetreatment

3 討論

藥物靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)基因功能及KEGG通路富集分析顯示，新方在GO基因功能包括細(xì)胞外谷氨酸門控離子通道活動、離子型谷氨酸受體信號通路、谷氨酸受體信號通路、谷氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA) 受體活性、NMDA選擇性受體復(fù)合物、海人酸選擇性谷氨酸受體活性、用于蛋白質(zhì)翻譯的轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸(Transfer ribonucleic acid，tRNA)氨?；?、突觸后膜、化學(xué)突觸傳遞、甘氨酸結(jié)合、氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、線粒體基質(zhì)、細(xì)胞連接處、尿素循環(huán)、離子跨膜運(yùn)輸、tRNA結(jié)合、氨基酸結(jié)合、突觸傳遞，甘氨酸能、興奮性突觸后電位等多個條目。藥物靶標(biāo)-疾病靶標(biāo)進(jìn)行基因功能分析結(jié)果表明，新方可能的靶標(biāo)基因與氨基酸的生物合成、氨基酸代謝、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝、其他氨基酸的代謝、谷氨酸能突觸、氨酰-tRNA的生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、信號分子和相互作用等多個條目有關(guān)。新方在GO基因功能和基因功能分析結(jié)果顯示，與氨基酸代謝特別是谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、脯氨酸等代謝密切相關(guān)。有研究指出，咽部是人體重要的儲菌庫，所以咽部細(xì)菌的分布可能與慢性咽炎發(fā)病原因與機(jī)制存在一定的關(guān)系，溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌、流行性感冒桿菌及病毒等病原微生物的異常增加導(dǎo)致菌群的平衡失調(diào)[13]。推測新方的中藥成分有可能通過影響人體的氨基酸代謝從而對咽喉部位的菌群環(huán)境形成了有效的調(diào)節(jié)作用，從而間接提高對咽喉疾病的治療效果。

結(jié)合網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶標(biāo)功能富集分析、關(guān)鍵靶標(biāo)的通路富集分析、中藥-成分-關(guān)鍵藥靶-通路網(wǎng)絡(luò)可視化分析的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)圖中新方化學(xué)成分對于喉痹的干預(yù)主要集中在氨基酸代謝相關(guān)通路的靶標(biāo)上。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前對于西醫(yī)對于咽喉疾病的干預(yù)機(jī)制研究多集中于直接的抗菌抗病毒方面[14]，中醫(yī)對于喉痹的機(jī)制多處于對證施治方面，在分子機(jī)制有關(guān)方面的研究較少。依據(jù)中醫(yī)經(jīng)絡(luò)循行理論，咽喉是經(jīng)脈循行交會之處，在十二經(jīng)脈中，除手厥陰心包經(jīng)和足太陽膀胱經(jīng)間接通于咽喉外，其他經(jīng)脈直接通達(dá)。在中醫(yī)治療中，刺激大腸經(jīng)和小腸經(jīng)穴位可以治療咽喉炎癥。大腸經(jīng)內(nèi)屬于大腸，小腸經(jīng)內(nèi)屬于小腸，表明在腸道和咽喉之間存在密切的經(jīng)絡(luò)關(guān)聯(lián)，可以通過刺激調(diào)整腸道來治療咽喉疾病。鄧燕飛[15]在研究慢性咽喉炎與胃腸道疾病的相關(guān)性時注意到治療消化道疾病的同時咽喉疾病也有所改善的特點(diǎn)。張莉[16]研究上呼吸道微生態(tài)平衡研究與益生菌制劑的關(guān)系，提出慢性咽炎通過類似腸道微生態(tài)制劑的方式進(jìn)行微生態(tài)平衡研究的設(shè)想。余鴻亮[17]運(yùn)用微生態(tài)制劑整腸生對慢性咽炎患者進(jìn)行混懸液含漱和口服整腸生膠囊，取得顯著治療效果。以上研究證實(shí)運(yùn)用腸道微生態(tài)制劑治療咽喉疾病的可行性。歐陽萬金等[18]研究谷氨酰胺對動物腸道微生態(tài)的積極影響。同時腸道菌群能利用蛋白質(zhì)殘渣合成非必需氨基酸，如天冬氨酸、丙氨酸、纈氨酸和蘇氨酸等。結(jié)合中醫(yī)刺激大腸經(jīng)和小腸經(jīng)穴位治療咽喉炎癥的實(shí)踐，西醫(yī)運(yùn)用氨基酸代謝平衡菌群微生態(tài)以及對腸道微生態(tài)制劑治療咽喉疾病的研究，而進(jìn)一步證實(shí)了本研究所推測的中藥新方通過氨基酸代謝通路干預(yù)微生物菌群的平衡從而治療喉痹的結(jié)論。

咽喉疾病作為常見病高發(fā)病，西醫(yī)對外部的微生物影響因素研究較多，但是缺乏特異性的治療措施，目前臨床上主要治療措施是使用抗菌藥物和抗病毒藥物，無法應(yīng)對致病菌的多樣性和用藥單一混亂的耐藥性問題，容易使得患者病情反復(fù)難以痊愈，同時長期大量使用抗菌藥物、激素會對患者健康產(chǎn)生不利影響[19]。筆者通過中醫(yī)傳承輔助平臺，挖掘并分析經(jīng)典名方新方，經(jīng)過分子機(jī)制關(guān)聯(lián)進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)存在與氨基酸代謝通路的關(guān)聯(lián)性，并且形成了中藥組方通過氨基酸代謝通道影響咽喉部微生物群落平衡的觀點(diǎn)，在諸多的研究中得到了一定程度的證實(shí)。這為下一步的深入研究提供方向性的啟示。目前這方面的文獻(xiàn)報道還不充分，還有待于更多的深入研究工作提供數(shù)據(jù)支持。本研究僅是基于現(xiàn)有研究結(jié)果的一個預(yù)測，具體的機(jī)制還需要具體的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。