小檗堿調(diào)控TLR4/NF?κB 信號通路抑制宮頸癌Hela 細胞增殖研究

洪丹丹 任青玲 徐傳花 徐雯雯 王偉 榮慧 郭紅玉 趙玉芹 馬蔚蓉 曹丹丹 陳冰倩

南京中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦科（南京210000）

流行病學研究發(fā)現(xiàn)我國目前宮頸癌發(fā)生率位居世界第一，占每年新增病例29%左右［1］。小檗堿是從黃連、黃柏等中藥中提取的季胺類化合物［2］，可通過調(diào)控p65 等凋亡分子［3］和抑制微管蛋白聚集［4］等途徑抑制宮頸癌細胞增殖，但是機制仍尚未明確。Toll 樣受體（Toll?like receptors，TLRs）可調(diào)控炎癥反應和免疫應答，介導機體天然免疫轉(zhuǎn)向獲得性免疫［5］。TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個TLR相關蛋白，其下游通路主要通過髓樣分化因子88激活后介導，進一步核因子κB（nuclear factor κB，NF?κB）活化［6］。NF?κB是一類具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的Rel 家族轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞增殖與凋亡過程［7］。小檗堿對于宮頸癌細胞具有明確的抑制作用，但TLR4?NF?κB是否小檗堿抗癌的具體通路尚未見相關報道。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料 Hela 細胞由江蘇凱基生物提供。小檗堿購自阿拉丁試劑有限公司（純度≥95%，貨號：B139120）；Trizol 購自美國Invitrogen（貨號：15596?026）；Lipo 2000（貨號：12566014）和cDNA 第一鏈合成試劑盒（貨號：K1622）購自美國TFS；Real time PCR Master Mix 購自日本TOYOBO（貨號：QPR?201）。

1.2 TLR4 siRNA 設計 通過Ambion 網(wǎng)站數(shù)據(jù)針對TLR4 基因設計3 條特異性siRNA 序列：TLR4?siRNA?001（上游：CCUGGUGAGUGUGACUAUUTT；下游：AAUAGUCACACUCACCAGGTT）、TLR4?siR?NA?002（上游：CCUGAACCCUAUGAACUUUTT；下游：AAAGUUCAUAGGGUUCAGGTT）、TLR4?siRNA?003（上游：GGACCUCUCUCAGUGUCAATT；下游：UUGACACUGAGAGAGGUCCTT）。隨機設計陰性對照siRNA（negative siRNA），上游：UUCUCCGAA?CGUGUCACGUTT；下游：ACGUGACACGUUCGGA?GAATT。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將宮頸癌Hela 細胞以每孔2×105個接種于6 孔板，細胞培養(yǎng)至70%～80%融合度時，進行Lipo 轉(zhuǎn)染。實驗分為3 組：空白對照組（control 組）、陰性siRNA 組（negative siRNA組）和TLR4?siRNAs 組（siRNA?001 組，siRNA?002組和siRNA?003 組）。

1.4 qRT?PCR 檢測 siRNA 轉(zhuǎn)染24 h 后收集細胞，Trizol 法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行PCR 擴增。TLR4 引物的上游為AGCACTTGGACC?TTTCCAGC，下游為TAGGGTTCAGGGACAGGTCT。內(nèi)參GAPDH 引物的上游為TGTTGCCATCAAT?GACCCCTT，下游 為CTCCACGACGTACTCAGCG。反應條件為95 ℃5 min，95 ℃15 s，60 ℃20 s，72 ℃40 s，共40 個循環(huán)。

1.5 Western檢測 siRNA轉(zhuǎn)染8 h后收集細胞，提取總蛋白，BCA 法定量。取40 μg 蛋白上樣，進行10%的SDS?PAGE，濃縮膠80 V、分離膠120 V 恒壓電泳，300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h。加入兔抗人TLR4 或GAPDH抗體過夜，次日羊抗兔IgG孵育，顯色曝光，采集圖像。使用Gel?Pro32 軟件對結(jié)果進行灰度分析。

1.6 MTT 法描繪細胞生長曲線 收集轉(zhuǎn)染24 h細胞，消化、計數(shù)、配制成濃度為3×104個/mL 的細胞懸液，分別培養(yǎng)0、24、48 和72 h；進行MTT 染色，測定OD值，計算抑制率描繪生長曲線。

1.7 Transwell 小室評價細胞遷移能力檢測 Hela密度1 × 105個/mL 細胞懸液100 μL 加入Transwell小室，下室加入500 μL 含20%FBS 的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h，進行固定、染色。直徑上取3 個視野照相（×200），計數(shù)。

1.8 熒光TUNEL 法檢測細胞凋亡 自然晾干細胞樣本（細胞涂片或爬片），多聚甲醛固定。在樣本上加1%的Triton?100，洗滌、滅活酶、洗滌、蛋白酶K 修復后進行TUNEL 反應1 h，DAPI 復染，熒光顯微鏡觀察。細胞凋亡指數(shù)（AI）=（凋亡細胞數(shù)÷細胞總數(shù)）×100%，凋亡細胞的細胞核為棕色，正常細胞的細胞核為藍紫色。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，以均數(shù)±標準差形式表述數(shù)據(jù)，組間比較采用student?t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率分析及目標TLR4?siRNA 篩選 轉(zhuǎn)染24 h，隨機選取10 個低倍視野，計數(shù)轉(zhuǎn)染細胞占總細胞數(shù)的百分比，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率達到（90.55 ± 5.19）%。3 組TLR4?siRNA 均可以有效沉默TLR4 的表達，分別為57.2%、74.0%和55.6%（P＜0.05），siRNA?002 下調(diào)最為明顯故將siRNA?002 選為目標siRNA 進行后續(xù)實驗。

2.2 不同濃度小檗堿對宮頸癌Hela 細胞增殖水平影響 見圖1，小檗堿（5、10 和40 μg/mL）呈濃度依耐性抑制Hela 細胞增殖，其中40 μg/mL 最為明顯，24、48 和72 h 的抑制率分別為20.15%、32.21%和39.82%（P＜0.05）。增加陰性siNRA 干預后，Hela 細胞增殖抑制率未見明顯改變。增加siRNA?002 干預后，可明顯增加三種濃度小檗堿對于Hela 細胞增殖的抑制作用，其中40 μg/mL 小檗堿+siRNA?002 最為明顯，24、48 和72 h 的抑制率分別為28.04%、65.87%和78.55%（P＜0.05）。

圖1 不同濃度小檗堿對宮頸癌Hela 細胞增殖水平影響Fig.1 Effects of different concentrations of berberine on the proliferation level of Hela cells in cervical carcinoma

2.3 不同濃度小檗堿對宮頸癌Hela 細胞遷移水平影響 見圖2，小檗堿（5、10 和40 μg/mL）可呈濃度依耐性抑制Hela 細胞遷移，遷移細胞數(shù)分別為141.00 ± 3.61、106.33 ± 3.51 和65.33 ± 3.51（P＜0.05）。增加陰性siNRA 干預后，Hela 細胞增殖抑制率未見明顯改變（P＞0.05）。增加siRNA?002 干預后，可見siRNA?002 可明顯增加3 種濃度小檗堿對于Hela 細胞增殖的抑制作用，其中40 μg/mL 小檗堿+siRNA?002 最為明顯（P＜0.05），遷移細胞數(shù)為43.67±3.79。

圖2 不同濃度小檗堿對宮頸癌Hela 細胞遷移水平影響Fig.2 Effects of different concentrations of berberine on migration levels of Hela cells in cervical carcinoma

2.4 不同濃度小檗堿對宮頸癌Hela 細胞凋亡水平影響 見圖3，小檗堿（5、10 和40 μg/mL）可明顯抑制Hela 細胞凋亡程度，凋亡率分別為（3.8 ±0.3）%、（7.2±0.5）%和（9.1±0.9）%。增加陰性siN?RA 干預后，Hela 細胞凋亡率未見明顯改變。加用siRNA?002 后可進一步增加Hela 細胞凋亡程度，凋亡率分別為（6.4 ± 0.8）%、（12.2 ± 1.1）%和（15.2 ±1.2）%。

圖3 TUNEL 評價不同濃度小檗堿對宮頸癌Hela 細胞凋亡水平影響Fig.3 Evaluation of different concentrations of berberine on the apoptosis level of Hela cells in cervical carcinoma by TUNEL

2.5 不同濃度小檗堿對宮頸癌Hela 細胞p65、Bcl?2 和TLR?4 mRNA 水平表達影響 見圖4，小檗堿可呈濃度依賴性抑制Hela 細胞p65、Bcl?2 和TLR4 的mRNA 表達水平（P＜0.05）。增加陰性siNRA 干預后，p65、Bcl?2 和TLR4 的mRNA 水平未見明顯改變。而加用siRNA?002 后可進一步加強小檗堿對于Hela 細胞p65、Bcl?2 和TLR4 mRNA 水平的下調(diào)作用（P＜0.05）。

2.6 不同濃度小檗堿對宮頸癌Hela 細胞p65、Bcl?2 和TLR4 蛋白水平表達影響 見圖5，小檗堿均可呈濃度依賴性抑制Hela 細胞p65、Bcl?2 和TLR?4蛋白表達（P＜0.05）。增加陰性siNRA 干預后，p65、Bcl?2 和TLR4 蛋白未見明顯改變。而加用siRNA?002 后可進一步加強小檗堿對于p65、Bcl?2和TLR 蛋白的下調(diào)作用（P＜0.05）。

圖4 不同濃度小檗堿對宮頸癌Hela 細胞p65、Bcl?2 和TLR4 mRNA 水平表達影響Fig.4 Effects of different concentrations of berberine on the mRNA levels of p65，bcl?2 and TLR4 mRNA in Hela cells of cervical carcinoma

圖5 不同濃度小檗堿對宮頸癌Hela 細胞p65、Bcl?2 和TLR?4 蛋白水平表達影響Fig.5 Effects of different concentrations of berberine on the expression protein levels of p65，bcl?2 and tlr?4 in Hela cells of cervical carcinoma

3 討論

TLRs 作為一種新的模式識別受體，是天然免疫和獲得性免疫之間的紐帶，也是細胞內(nèi)信號通道的起始部位［8］。本研究選擇的TLR4 主要表達于結(jié)腸癌、乳腺癌和宮頸癌等多種細胞膜表面，與細胞增殖程度呈正相關［9］。本研究結(jié)果提示小檗堿成濃度依耐性抑制細胞增殖，促進凋亡，減低遷移能力，說明小檗堿具有明顯的抗宮頸癌效果。小檗堿能夠抑制宮頸癌細胞增殖，促進凋亡，阻滯細胞周期，增加宮頸癌細胞的放射敏感性［10］。小檗堿作為我國傳統(tǒng)中藥黃連等的有效成分，亦有許多國外研究報道其對于宮頸癌有效。比如RAGHAV 等［4］通過傅里葉變換紅外光譜發(fā)現(xiàn)小檗堿可改變Hela 細胞內(nèi)微管蛋白異構(gòu)體構(gòu)象，抑制細胞內(nèi)骨架的搭建，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究結(jié)果與上述研究相符，均證實小檗堿對于Hela細胞具有抑制作用。

對于小檗堿抗宮頸癌的相關具體機制研究報道較少，小檗堿可能通過降低金屬基質(zhì)蛋白酶-9和NF?κBp65 水平，對Hela 細胞體外增殖具有明顯的抑制作用，能夠減弱Hela 細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可以明顯抑制Hela 細胞中TLR4mRNA 和蛋白的表達水平，并進一步下調(diào)p65 和Bcl?2 表達。p65 是NF?κB 家族的組分之一，靜息狀態(tài)下p65 與IκB 結(jié)合固定，當受到核外刺激后，IκB 被磷酸化而降解，從而釋放p65 與κB位點基因特異性結(jié)合，發(fā)揮下游調(diào)節(jié)作用，其中Bcl?2 家族就是下游調(diào)節(jié)靶點之一［12-14］。Bcl?2 家族蛋白可通過與其他凋亡調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用，其主要發(fā)揮抗凋亡作用［15-16］。因此本研究中小檗堿可明顯下調(diào)Bcl?2 表達，即抑制Hela 細胞自身的抗凋亡能力。已有研究證實TLR4?NF?κB為宮頸癌細胞的重要代謝通路，比如有研究發(fā)現(xiàn)TLR4?siRNA可進一步通過調(diào)控NF?κB通路下調(diào)Bcl?2水平，顯著抑制細胞增殖，促進細胞凋亡［17］。本研究結(jié)果與之相符，并進一步證明小檗堿與TLR4?siRNA 作用相同，均可抑制TLR4表達，發(fā)揮抗宮頸癌作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可調(diào)控TLR4?NF?κB 信號通路下調(diào)Bcl?2 表達，顯著抑制Hela 細胞的增殖，促進其凋亡，為小檗堿治療宮頸癌提供新的理論依據(jù)。