菌根共生對鐵皮石斛生長發(fā)育的影響

王秋霞 胡虹

摘要：以鐵皮石斛（Dendrobium officinale）為試材，采用菌根真菌（S1和S3）與鐵皮石斛幼苗共培養(yǎng)的方法，研究了菌根共生對鐵皮石斛幼苗階段生長發(fā)育的影響。結(jié)果表明：共培養(yǎng)前期，菌根真菌（S1和S3）與寄主保持著共生關(guān)系;后期，這種共生關(guān)系逐漸消失，真菌菌絲大量聚集在根外。菌根真菌在鐵皮石斛生長前期促生作用強(qiáng)于生長后期，表明菌根真菌在蘭科幼苗生長階段仍保持著一定的促生作用，但隨著共生關(guān)系的消解，促生作用也逐漸減弱。

關(guān)鍵詞：菌根共生;生長發(fā)育;鐵皮石斛;菌根真菌

中圖分類號：S682.31??文獻(xiàn)標(biāo)識號：A??文章編號：1001-4942（2019）01-0055-06

Effects of Mycorrhizal Symbiosis on Growth and

Development of Dendrobium officinale

Wang Qiuxia?Hu Hong?2

（1.Department of Life Sciences and Technology， Kunming University， Kunming ?650214， China;

2. Key Laboratory of Economic Plants and Biotechnology， Kunming Institute of Botany，

Chinese Academy of Sciences， Kunming ??650201， China）

Abstract?Dendrobium officinale was used as experimental materials. Through the co-culture experiment of D. officinale seedlings with mycorrhiza fungi Epulorhiza sp. （S1） or Tulasnella sp. （S3）， the influences of mycorrhizal symbiosis on growth and development of D. officinale seedlings were investigated. The results showed that the mycorrhiza fungi （S1 and S3） kept the symbiotic relationship with their hosts at the earlier stage， and the symbiotic relationship gradually disappeared at the later stage. A large number of hyphae gathered outside the roots. Both S1 and S3 fungi promoted better growth of D. officinale at the earlier stage than at the later stage. In conclusion， the mycorrhizal symbiosis maintained a certain role at the earlier growth stage of Orchidaceae seedlings. However， with the dissolution of symbiotic relationship， the promoting effect was gradually weakened.

Keywords?Mycorrhizal symbiosis; Growth and development; Dendrobium officinale; Mycorrhiza fungi

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，是傳統(tǒng)名貴藥食兩用中藥材，因具有滋陰清熱、益胃生津、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、降血壓、降血糖、抗氧化和抗衰老等多種功效，被列為“中華九大仙草之首”，素有“藥中黃金”之美稱。野生鐵皮石斛一般生長在海拔?1 600 m?以下的樹干、山谷和溝邊的半陰濕巖石上，種子微小無胚乳，在自然條件下萌發(fā)率極低，且其生境的破壞和過度采挖使野生鐵皮石斛資源日趨瀕危，已被列入《國家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種名錄》和《中華人民共和國珍稀瀕危植物名錄》[1]。

菌根共生在蘭科植物的生長和生命活動中具有重要作用，尤其是在蘭科種子萌發(fā)和原球莖發(fā)育階段[2，3]，與蘭科植物息息相關(guān)。自然生態(tài)條件下，只有感染了合適的真菌后蘭科植物種子才能萌發(fā)生長[4，5]。但目前有關(guān)菌根共生對蘭科植物幼苗生長發(fā)育階段的影響研究相對較少。研究表明，一些蘭科植物的葉片長出后可以進(jìn)行光合作用，因而不再需要菌根真菌提供能源物質(zhì)，說明當(dāng)宿主植物長到一定階段后，可以獨(dú)立于真菌而存在[6];但有些蘭科植物在能進(jìn)行光合作用階段仍與菌根真菌保持共生關(guān)系，這對宿主生長發(fā)育會產(chǎn)生怎樣的作用尚不明確。本研究通過菌根真菌和鐵皮石斛幼苗共培養(yǎng)的方法，探討菌根共生對鐵皮石斛幼苗生長發(fā)育的影響，旨在為蘭科菌根研究提供理論基礎(chǔ)，為鐵皮石斛資源利用和人工繁育提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

鐵皮石斛4個月苗齡的無菌苗;菌根真菌Epulorhiza sp. （S1） 和Tulasnella sp. （S3），從野生鐵皮石斛根部分離得到。

1.2?共培養(yǎng)試驗(yàn)

1.2.1?共培養(yǎng)?共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為1/2MS+?0.75%?蔗糖+0.75%瓊脂[7]。選取鐵皮石斛4個月苗齡的無菌苗，在超凈工作臺上轉(zhuǎn)接入玻璃組培瓶中（容積600 mL，瓶口內(nèi)徑5 cm）的定量（100 mL/瓶）共生培養(yǎng)基中，每瓶8株幼苗。將S1和S3真菌在PDA平板上培養(yǎng)，待菌絲長滿平板，備用。接苗前先在電子天平上稱量裝有培養(yǎng)基的組培瓶重量（精確到0.01 g），接入苗后再稱重，計(jì)算每瓶的苗重。7 d后，選取無污染的苗，用打孔器（0.33 cm?2）打取PDA平板培養(yǎng)基上活化的S1和S3菌株瓊脂塊，每瓶接入一個帶菌的瓊脂小塊，置于培養(yǎng)瓶中心的培養(yǎng)基上，使染菌的瓊脂塊離8株幼苗的距離大致相同;對照組接入無菌瓊脂塊。每處理25個重復(fù)。所有接菌處理苗和對照苗均置于溫度（26±1）℃、光照50 μmol·m??-2?·s??-1?、光周期12 h/d的組培室內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2?鐵皮石斛生長指標(biāo)的測定?共培養(yǎng)60、120、180、240、360 d時，觀察每個處理組和對照組鐵皮石斛苗的長勢，并拍照。準(zhǔn)確稱取處理組和對照組苗的重量，結(jié)合處理前的重量，計(jì)算苗鮮重的增長量。測量株高、莖長、莖粗、節(jié)間長，統(tǒng)計(jì)新根數(shù)、分蘗株數(shù)和莖節(jié)數(shù)。然后將苗置80℃烘箱中48 h，記錄苗的干重。以上均以瓶為單位統(tǒng)計(jì)。

1.2.3?菌根共生情況的觀察?取共培養(yǎng)不同階段鐵皮石斛苗的根觀察菌根共生情況。采集樣品時，保護(hù)好根系，洗去根部附著的培養(yǎng)基，拍照。隨機(jī)選取各處理苗的健康營養(yǎng)根段，放入無水乙醇中固定24 h以上，取出置10% KOH溶液中過夜，然后轉(zhuǎn)移到染液中浸染60 min。染液組成：10 μg/mL WGA-AF（wheat germ agglutinin-alexa fluor conjugate）488;0.02%吐溫20;1×PBS（137 mmol/L NaCl，27 mmol/L KCl，100 mmol/L Na2HPO4， 2 mmol/L K2HPO4， pH 7.4）。在染色過程中，抽真空3次。染色結(jié)束后，將樣品轉(zhuǎn)移到PBS緩沖液中漂洗3次，再放入20 μg/mL碘化丙啶（PI）染液中染色 3 min，取出后用 PBS 緩沖液漂洗3次[8]，最后將樣品放在載玻片上，用激光共聚焦顯微鏡（OLYMPUS FV1000）進(jìn)行觀察并拍照。WGA-AF 488 激發(fā)光為 488 nm 激光，檢測光為 500～540 nm;PI 激發(fā)光為 559 nm 激光，檢測光為 570～619 nm。

1.3?數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，不同處理間的差異比較采用單因素方差分析（ANOVA）和LSD檢驗(yàn)。用SigmaPlot 10.0軟件繪圖。

2?結(jié)果與分析

2.1?菌根真菌與不同生長階段鐵皮石斛根共生情況

圖1顯示，對照苗CK的根在共培養(yǎng)期間，結(jié)構(gòu)無大的變化，在共培養(yǎng)360 d時，有少量根毛存在。接菌苗在接菌60 d時根的皮層細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)有菌絲或菌絲團(tuán)存在，120～180 d時有大量的菌絲定殖于皮層細(xì)胞內(nèi)，根外聚集了大量的菌絲;240 d后，根的皮層細(xì)胞內(nèi)菌絲或菌絲團(tuán)基本消失，但鐵皮石斛的根毛較發(fā)達(dá)，菌絲纏繞在根毛上。

2.2?菌根共生對鐵皮石斛不同階段生長發(fā)育的影響

由圖2可見，鐵皮石斛所有處理苗均健康生長，接種S1和S3真菌的幼苗均比未接菌苗旺盛，分蘗株明顯多于對照。在接種240 d后，S1接菌苗已經(jīng)有開花現(xiàn)象。而在S3接菌苗和對照苗中未發(fā)現(xiàn)開花植株。

由圖3可見，鐵皮石斛S1接菌苗的鮮重增長量在整個生長過程中都顯著高于對照苗，而S3接菌苗的鮮重增長量在生長前期顯著高于對照苗（P<0.05），生長后期差異不顯著。接菌苗的干重在整個生長過程中顯著高于對照苗（P<?0.05）。

由圖4和圖5可見，接菌苗的莖粗和莖長在生長前期顯著高于對照苗（P<0.05），而后期與對照苗無顯著差異。接菌苗的節(jié)間長在接種60 d和120 d時，與對照苗均有顯著差異（P<0.05），180 d時與對照苗無顯著差異;但240 d時，S1接菌苗的節(jié)間長顯著高于對照苗（P<0.05），S3接菌苗與對照苗無顯著差異;360 d時接菌苗的節(jié)間長又顯著高于對照苗的?（P<?0.05）。接菌苗株高在接種后120 d內(nèi)顯著高于對照苗的（P<?0.05），?180 d后差異不顯著。

由圖6可見，接菌苗的節(jié)間數(shù)在接種60～180 d的生長期間顯著多于對照苗的（P<0.05），240 d后與對照苗無顯著差異。S1接菌苗的分蘗株數(shù)在360 d的共生期內(nèi)顯著高于對照苗的（P<?0.05），?S3接菌苗的分蘗株數(shù)在接種后180～240 d與對照苗無顯著差異。

由圖7可見，S1和S3接菌苗的新根數(shù)在接種60 d時均顯著多于對照苗（P<0.05）;120～180 d的共生期內(nèi)，S1接菌苗的新根數(shù)顯著多于對照苗（P<0.05），而S3接菌苗的新根數(shù)少于對照苗;240～360 d內(nèi)，接菌苗與對照苗的新根數(shù)無顯著差異（P>0.05）。

3?討論與結(jié)論

蘭科植物的種子萌發(fā)和原球莖生長階段都必須依靠菌根真菌為其提供營養(yǎng)[8]，但在幼苗生長階段菌根共生能持續(xù)多久尚不清楚;而且成年蘭科中菌根共生現(xiàn)象變化較大，所以菌根真菌對蘭科不同生長階段可能會產(chǎn)生不同的作用[9-15]。本研究中，兩種菌根真菌（S1和S3）在與鐵皮石斛共培養(yǎng)的過程中，隨著共培養(yǎng)時間的延長，與寄主的共生關(guān)系發(fā)生了變化，共培養(yǎng)60～180 d內(nèi)與鐵皮石斛保持著共生關(guān)系，240 d后共生結(jié)構(gòu)慢慢消失，表現(xiàn)出共培養(yǎng)前期對寄主的促生作用較大，后期對寄主的促生作用較弱。有些附生蘭在成年階段沒有菌根共生現(xiàn)象[16，17]，這可能是因?yàn)檫@些蘭科植物在具備光合能力后，光合產(chǎn)物及根部的營養(yǎng)吸收能滿足自身生長發(fā)育的營養(yǎng)需求，所以就完全脫離了菌根真菌。由此推測，部分蘭科植物在成年階段仍然與菌根真菌保持著共生關(guān)系，可能是因?yàn)樽陨砩袩o法滿足生長發(fā)育的需求，需要形成菌根共生來提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)。

本研究中，我們還觀察到菌根真菌可以誘導(dǎo)鐵皮石斛根產(chǎn)生大量根毛，這一現(xiàn)象在蘭科已有的研究中尚未見報(bào)道;而且，在共培養(yǎng)試驗(yàn)中，接種S1和S3真菌的鐵皮石斛幼苗新根數(shù)顯著高于未接菌苗。研究發(fā)現(xiàn)，菌根真菌能誘導(dǎo)鐵皮石斛的支根數(shù)量增加[18]。菌根植物根毛密度越大，真菌定殖率越高，暗示著菌根真菌對寄主的作用越強(qiáng);菌根真菌對寄主的作用及在寄主根部的定殖率也受根毛長度和根冠比的影響[19];菌根真菌還可以增加寄主支根分裂程度、側(cè)根的長度與數(shù)量，從而增加寄主與生長基質(zhì)的接觸面積，有助于從基質(zhì)中吸收更多的養(yǎng)分，進(jìn)而促進(jìn)寄主的生長[20]。由此可見，S1和S3菌根真菌能促進(jìn)鐵皮石斛幼苗生長發(fā)育的原因之一可能是菌根共生使鐵皮石斛產(chǎn)生大量的根毛及新根，增加了與生長基質(zhì)的接觸面積，從而促進(jìn)根部營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。

綜上所述，菌根真菌S1和S3與鐵皮石斛幼苗形成了共生關(guān)系，但隨著共培養(yǎng)時間的延長，這種共生關(guān)系逐漸消解，共培養(yǎng)240 d后對鐵皮石斛幼苗生長發(fā)育的影響逐漸減弱。這為蘭科植物的菌根研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)，為鐵皮石斛的人工繁育提供了一定的理論依據(jù)。

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