曲妥珠單抗聯(lián)合吉西他濱對卵巢癌小鼠移植瘤生長及免疫功能的影響

張 皓 周躍華 堯良清

(復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海 200011)

卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，其致死率占各類婦科腫瘤的首位，對女性生命造成嚴重威脅[1-3]。化療是重要的輔助治療手段，在卵巢癌的臨床治療中有重要作用。常用的化療藥物包括：吉西他濱、曲妥珠單抗、卡培他濱等。吉西他濱為抗腫瘤藥物，進入人體內(nèi)后由脫氧胞嘧啶激酶活化，可破壞癌細胞復制過程，改善患者生活質量，對卵巢癌、非霍奇金淋巴瘤等均具有一定療效[4-6]。曲妥珠單抗是抗Her2的單克隆抗體，可通過附著于Her2，阻止人體表皮生長因子在Her2上附著，達到阻斷癌細胞生長的作用，同時還可激發(fā)機體自身免疫細胞抵制癌細胞[7-8]。環(huán)氧合酶2(Cox-2)能催化合成前列腺素并參與炎癥反應，研究認為，在卵巢癌中，Cox-2高表達，下調Cox-2表達可以抑制卵巢癌細胞增殖[9]。本研究通過制備人卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤模型，觀察曲妥珠單抗聯(lián)合吉西他濱對SKOV3裸鼠移植瘤生長的抑制情況及可能的機制，并對小鼠免疫功能因子水平的影響進行分析。以期為臨床治療卵巢癌提供聯(lián)合用藥的實驗依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及細胞 BALB/c裸小鼠42只，雌性，4～5周齡，體質量18～20 g，購自上海加科生物科技有限公司。飼養(yǎng)1周后，隨機選取40只小鼠分為4組：對照組、模型組、吉西他濱組和聯(lián)合組，每組10只。人卵巢癌SKOV3細胞株購自上海匹拓生物科技有限公司。

1.1.2實驗試劑 曲妥珠單抗(上海羅氏制藥有限公司)、吉西他濱(北京協(xié)和藥廠)、ELISA試劑盒(上海恒遠生物科技有限公司)、胎牛血清(上海勁馬實驗設備有限公司)、RPMI1640培養(yǎng)基(上海浩然生物技術有限公司)、總蛋白提取試劑盒(上海睿安生物科技有限公司)、蛋白質印跡試劑盒(上海容創(chuàng)生物技術有限公司)、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術有限公司)、Cox-2兔抗鼠多克隆抗體(艾博抗貿(mào)易有限公司)。

1.2方法

1.2.1移植瘤動物模型的制備[10]待傳代培養(yǎng)的SKOV3細胞增殖至鋪滿培養(yǎng)瓶底部后，取對數(shù)生長期細胞，PBS清洗后，調至活細胞濃度為4×107個/ml的細胞懸液，各吸取0.1 ml，分別于無菌環(huán)境下接種于2只裸鼠右側腋窩皮下，10 d后形成移植瘤，處死裸鼠，取處于生長旺盛期的瘤組織剪成約1.0 mm3左右，無菌條件下接種于模型組、吉西他濱組及聯(lián)合組裸鼠右側腋窩皮下。對照組正常飼養(yǎng)，不給予任何處理。

1.2.2給藥方案 待各組小鼠體內(nèi)移植瘤長至約150 mm3時(約20 d)，分別取各組裸鼠稱重。治療給藥方案如下：①對照組：0.9%生理鹽水0.1 ml；②模型組：0.9%生理鹽水0.1 ml；③吉西他濱組：吉西他濱(50 mg/kg)0.1 ml；④聯(lián)合組：吉西他濱(50 mg/kg)0.1 ml+曲妥珠單抗(30 mg/kg)0.1 ml。各組均經(jīng)尾靜脈給藥，1次/周，連續(xù)治療6周。

1.2.3移植瘤觀察 隔日觀察各組裸鼠移植瘤生長情況及與治療藥物相關的不良反應。測量移植瘤長徑(a)及短徑(b)，稱取裸鼠體質量，1次/周。移植瘤體積(Tumor volume，TV)=1/2(ab2)。抑瘤率(%)=[(模型組瘤體積-實驗組瘤體積)/模型組瘤體積]×100%。

1.2.4病理學觀察 治療結束后1周，處死裸鼠，完整剝離瘤體，檢查肝、腎有無腫瘤轉移及有無腹水。取瘤組織進行HE染色，利用光學顯微鏡進行組織學觀察。

1.2.5Cox-2水平檢測 利用蛋白質印跡法檢測各組裸鼠瘤組織中Cox-2蛋白的表達。按照試劑盒說明書操作提取各組裸鼠瘤組織中總蛋白，于聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%積層膠，8%分離膠)分離蛋白；上樣，電泳；采用濕式轉膜方式檢測Cox-2的蛋白表達。

1.2.6免疫功能指標分析 各組裸鼠處死后，同時摘除眼球取血，室溫下靜置45 min，3 000 r/min離心15 min，吸取上層血清待檢測，利用ELISA 試劑盒檢測各組裸鼠血清中IFN-γ和IL-4水平，并計算IFN-γ/IL-4比值。實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1移植瘤生長情況 SKOV3細胞移植10 d時，在兩只裸鼠右側腋窩皮下均可見直徑約3 mm大小的類圓形硬塊，高出皮膚表面，不可移動，成瘤率為100%。將瘤塊接種于裸鼠后，模型組移植瘤生長良好，3周后體積逐漸增大，質硬，可活動，與胸壁不黏連。治療前各組裸鼠體質量及移植瘤體積比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。用藥治療后，吉西他濱組和聯(lián)合組移植瘤體積較模型組小，體質量較模型組低，且聯(lián)合組移植瘤體積與裸鼠體質量明顯低于吉西他濱組，抑瘤率明顯高于吉西他濱組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。未觀察到與治療藥物相關的腹瀉、食欲下降、脫毛等不良作用，處死裸鼠后，檢查心、肝、肺、腎、胃腸道均未見明顯腫瘤轉移灶及腹水。

2.2HE染色 HE染色結果顯示：①模型組：腫瘤細胞較多，排列緊密，細胞異型性明顯，核大深染，細胞核質比例明顯增大，可見核分裂相，少量凋亡細胞；②吉西他濱組和聯(lián)合組：腫瘤細胞數(shù)目減少，排列稀疏，細胞核染色較淺，細胞核質比例減小，核分裂相減少，細胞胞漿多為透明空泡狀，凋亡細胞核固縮，可見凋亡小體。各組裸鼠的肝、腎均未見特殊病理改變。見圖1。

2.3Cox-2蛋白表達水平 Western blot檢測結果顯示：與模型組比較，吉西他濱組和聯(lián)合組Cox-2蛋白表達有不同程度的減少，且聯(lián)合組Cox-2蛋白表達的抑制程度更明顯(P<0.05)。見表2、圖2。

表1 各組裸鼠移植瘤生長情況比較Tab.1 Comparison of growth of transplanted tumor in nude mice

圖1 各組小鼠形態(tài)學比較(HE，×400)Fig.1 Comparison of morphology of nude mice in each group(HE，×400)

圖2 Western blot檢測各組裸鼠Cox-2蛋白表達情況Fig.2 Expression of Cox-2 protein in nude mice detected by Western blot

表2 Cox-2蛋白表達情況比較Tab.2 Comparison of Cox-2 protein expression

表3 各組裸鼠免疫功能指標水平比較Tab.3 Comparison of immunological index levels in nude mice

2.4免疫功能指標分析 與對照組比較，模型組、吉西他濱組和聯(lián)合組裸鼠血清中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，吉西他濱組和聯(lián)合組裸鼠血清中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4水平均明顯升高，且聯(lián)合組升高趨勢更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

3 討論

長期以來，卵巢癌都被視作女性健康的隱性殺手。卵巢癌進展過程中，不同的免疫細胞及細胞因子相互作用，可導致免疫反應的動態(tài)變化[10]。目前，臨床治療卵巢癌一般根據(jù)腫瘤病理類型不同而選擇相應的治療方案，包括手術治療、化療、結合中醫(yī)中藥等綜合治療。吉西他濱為抗癌常用藥物，能改善患者的生活質量，對多種實體腫瘤具有較好的治療效果[11-14]。曲妥珠單抗是一種重組DNA衍生的人源化單克隆抗體，具有較強的抗腫瘤活性[15]。本實驗結果發(fā)現(xiàn)：本次SKOV3細胞移植成瘤率為100%。將瘤塊接種于裸鼠后，模型組瘤塊體積逐漸增大，質硬，可活動，與胸壁不黏連。用藥治療后，與模型組比較，吉西他濱組和聯(lián)合組移植瘤體積減小，體質量降低，且聯(lián)合組移植瘤體積與裸鼠體質量明顯低于吉西他濱組，抑瘤率明顯高于吉西他濱組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，吉西他濱組和聯(lián)合組腫瘤細胞數(shù)目減少，可見凋亡小體。表明，吉西他濱和曲妥珠單抗對移植瘤生長均有抑制作用，且聯(lián)合用藥對移植瘤的抑制作用更明顯。

環(huán)氧化酶即前列腺素內(nèi)氧化酶還原酶，具有環(huán)氧化酶和過氧化氫酶活性。Cox-2為其誘導型同工酶，可通過誘導花生四稀酸氧化，及其他加速腫瘤細胞形成的活化產(chǎn)物的產(chǎn)生，促進腫瘤細胞的增殖，其在卵巢惡性腫瘤中的表達高于正常的卵巢組織中[16]。本次實驗結果顯示：吉西他濱組和聯(lián)合組裸鼠Cox-2蛋白表達水平均明顯低于模型組，且聯(lián)合組變化趨勢更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明吉西他濱和曲妥珠單抗均可下調卵巢癌裸鼠Cox-2蛋白表達，且聯(lián)合用藥對Cox-2蛋白抑制作用更明顯。已有研究表明，曲妥珠單抗可通過下調腫瘤組織中Cox-2表達，促進腫瘤細胞凋亡[17]。因此推斷，聯(lián)合用藥對腫瘤生長的抑制作用與抑制Cox-2蛋白表達有關。

IFN-γ是水溶性二聚體細胞因子，由活化T細胞和自然殺傷細胞(NK cell)產(chǎn)生，具有免疫調節(jié)及抗腫瘤特性。研究表明，吉西他濱可以抑制ID8卵巢癌細胞移植瘤的生長。通過上調血清中IFN-γ和IL-2水平，改善荷瘤小鼠免疫功能[10]。目前關于卵巢癌荷癌小鼠體內(nèi)Th1/Th2細胞平衡的研究報道較少。王麗華等[18]報道，卵巢癌患者存在免疫功能紊亂，表現(xiàn)為Th1/Th2失衡。本研究選取IL-4為觀察指標。IL-4屬于Th2細胞產(chǎn)生的特征性細胞因子，具有增強特異和非特異性殺傷的作用。本次實驗結果顯示：模型組、吉西他濱組和聯(lián)合組裸鼠血清中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4水平均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。吉西他濱組和聯(lián)合組裸鼠血清中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4水平均明顯高于模型組，且聯(lián)合組水平升高趨勢更加明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明吉西他濱和曲妥珠單抗均可上調裸鼠血清中免疫功能指標因子及Th1/Th2細胞平衡水平，且聯(lián)合用藥對上述指標的調控作用更明顯。研究發(fā)現(xiàn)，曲妥珠單抗可以增加NK細胞對IFN-γ、TNF-α的分泌作用。其作用機制可能與影響細胞周期，抑制卵巢癌SKOV3細胞增殖有關。

綜上所述，曲妥珠單抗聯(lián)合吉西他濱可有效抑制裸鼠移植瘤生長，其機制可能與下調Cox-2蛋白表達有關，此外聯(lián)合用藥還能改善裸鼠免疫功能，對卵巢癌裸鼠具有一定治療效果。