IL-31通過調(diào)控TGF-β1/Smad4信號(hào)通路促進(jìn)骨質(zhì)疏松的機(jī)制研究

郝 喆 楊文靜 倪 娟

(武漢市第四醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，武漢 430033)

骨質(zhì)疏松是骨代謝障礙的一種全身性骨骼疾病，其特征在于骨組織的微小結(jié)構(gòu)退化和骨量的減少[1]。過度的骨吸收和/或不充分的骨形成易出現(xiàn)骨脆性增加和骨折發(fā)生[2]。破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)改變?cè)诠琴|(zhì)平衡和骨質(zhì)疏松的過程中發(fā)揮著重要的作用[3]。機(jī)體免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可通過促進(jìn)破骨細(xì)胞生成和抑制成骨細(xì)胞分化而促進(jìn)骨質(zhì)丟失[4]。IL-31屬于gp130/IL-6細(xì)胞因子家族，其受體在各器官組織中分布廣泛，免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞中均存在IL-31受體，IL-31參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、髓系造血等多種生理及病理過程[5]，但I(xiàn)L-31在骨質(zhì)疏松中的作用尚不清楚。因此本研究主要探討IL-31在骨質(zhì)疏松患者血清中的表達(dá)情況，并通過骨質(zhì)疏松小鼠模型及細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)探討IL-31調(diào)控骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病例資料 共納入2015年1月～2016年12月我院收治的100例骨質(zhì)疏松癥患者為研究對(duì)象(研究組)，其中男性29例、女性71例，年齡51～84歲，平均(66.4±13.3)歲。另按年齡、性別配對(duì)選取100例同期在本院健康體檢中心體檢的健康人群(對(duì)照組)，其中男性29例、女性71例，年齡51～84歲，平均(65.1±12.9)歲。

1.1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 研究組患者均符合骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)：即：①臨床表現(xiàn)：出現(xiàn)周身疼痛、身高降低、駝背、脆性骨折和呼吸系統(tǒng)受損等；②骨密度檢查：骨密度在年輕成人平均值2.5 SD以下(T值<-2.5 SD)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)不良或低鈣飲食；②伴有系統(tǒng)性疾?。虎蹛盒阅[瘤；④影響骨代謝藥物服用史；⑤代謝性疾??；⑥長(zhǎng)期臥床。

1.1.3試劑與儀器 主要試劑包括高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，美國(guó))，鏈霉素、青霉素鼠二抗和兔二抗、CCK8檢測(cè)試劑盒(碧云天，上海)，人IL-31 ELISA試劑盒轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(Thermo Fisher，美國(guó))，ALP檢測(cè)試劑盒(Beckman，美國(guó))，IL-31、TGF-β1、Smad4、p-Smad4和Actin抗體(Cell Signaling technology，美國(guó))，Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(BD，美國(guó))。鼠源IL-31 qPCR引物(正向5′-TCCTGATGTTCCCAA-CCCTG-3′、反向5′-TTAGGACCACGTCTTCTGTGT-3′)由上海生工生物合成。IL-31 shRNA (shIL-31)及對(duì)照shRNA(shCon)購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因。C57BL/6J野生型小鼠、C57BL/6J背景的IL-31基因敲除小鼠購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1購(gòu)自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心。主要設(shè)備包括細(xì)胞培養(yǎng)箱、生物安全柜、Biotek酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、Bio-Rad垂直電泳儀、Bio-Rad Western blot化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、Roche LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.2方法

1.2.1人外周血IL-31濃度測(cè)定 收集研究組和健康對(duì)照組志愿者的空腹血，離心分離上清，嚴(yán)格按照IL-31 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作、定量。

1.2.2骨質(zhì)疏松小鼠模型構(gòu)建 取健康的C57BL/6J野生型和IL-31敲除小鼠各30只，均為雌性、4～5周齡，隨機(jī)分為2組，即卵巢切除術(shù)組(OVX)15只、假手術(shù)組(Sham)15只，分別進(jìn)行手術(shù)操作。術(shù)后8周通過眼球取血獲得并分離小鼠血清，測(cè)定血清鈣離子、磷、ALP濃度；取OVX及Sham組小鼠的雙側(cè)股骨進(jìn)行病理切片分析股骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，分離脊柱并通過骨密度儀檢測(cè)脊柱骨密度值。

1.2.3BMSCs的體外培養(yǎng)與檢測(cè) 采用全骨髓法培養(yǎng)BMSCs細(xì)胞。細(xì)胞分離后置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，用0.25%的胰酶進(jìn)行消化傳代。當(dāng)細(xì)胞傳至第3代時(shí)，取各組BMSCs，計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)整濃度至1×105個(gè)/ml，接種于96孔板中，每孔100 μl細(xì)胞懸液、設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。接種后每48 h換液一次，并于第2、4、6天以CCK8法檢測(cè)各組細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，判斷細(xì)胞增殖活力。在細(xì)胞培養(yǎng)第4天，移除培養(yǎng)基，裂解細(xì)胞后通過全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定每孔細(xì)胞的ALP濃度。另取第3代BMSCs細(xì)胞，提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量，Western blot法檢測(cè)TGF-β1、Smad4和p-Smad4的表達(dá)，并以Actin為內(nèi)參。

1.2.4MC3T3-E1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及檢測(cè) 采用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染法將shIL-31和shCon轉(zhuǎn)染至MC3T3-E1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，計(jì)數(shù)細(xì)胞并接種于96孔板中，每隔48 h通過CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖；另通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，檢測(cè)IL-31的敲除效率和相應(yīng)蛋白表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究所有實(shí)驗(yàn)組均重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件分析，計(jì)量資料以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1骨質(zhì)疏松患者與健康人血清IL-31濃度比較 骨質(zhì)疏松患者的血清IL-31平均濃度(43.12±4.97)pg/ml顯著高于健康對(duì)照組人群的血清IL-31平均濃度(19.58±2.09)pg/ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1A)。進(jìn)一步將骨質(zhì)疏松患者分為輕度骨質(zhì)疏松(37例，T值<-2.5 SD)和重度骨質(zhì)疏松(63例， T值<-2.5 SD且有一次以上的骨質(zhì)疏松性骨折)后發(fā)現(xiàn)，重度骨質(zhì)疏松患者的血清IL-31平均濃度(51.52±6.90)pg/ml顯著高于輕度骨質(zhì)疏松患者的血清IL-31平均濃度(33.75±6.16)pg/ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1B)。

2.2骨質(zhì)疏松小鼠模型的建立 通過Sham和OVX手術(shù)建立骨質(zhì)疏松及對(duì)照模型小鼠。術(shù)后8周血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)顯示，野生型小鼠、IL-31敲除小鼠的OVX手術(shù)組的血鈣離子和血磷均高于Sham手術(shù)組、但ALP水平顯著低于Sham手術(shù)組(均P<0.05，見表1)。接受OVX手術(shù)的IL-31敲除小鼠血鈣離子和血磷濃度均明顯低于接受OVX手術(shù)的野生型小鼠、而ALP高于野生型小鼠(均P<0.05，見表1)。

圖1 骨質(zhì)疏松患者與健康人血清IL-31濃度比較Fig.1 Comparison of serum IL-31 between osteoporosis patients and healthy control groupNote: **.P<0.01,***.P<0.001.

術(shù)后8周小鼠股骨組織(圖2A)病理切片及脊柱骨密度結(jié)果(圖2B)顯示，接受OVX手術(shù)的野生型小鼠和IL-31敲除小鼠均出現(xiàn)骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞和骨密度降低，但I(xiàn)L-31敲除小鼠的骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)破壞程度和骨密度降低程度均較野生型小鼠輕(P<0.05)。

2.3BMSCs增殖及相關(guān)蛋白水平檢測(cè) 細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果顯示接受OVX手術(shù)的IL-31敲除小鼠組BMSCs的體外增殖能力顯著高于Sham手術(shù)的IL-31敲除小鼠組和接受OVX手術(shù)的野生型小鼠組(P<0.05，圖3A);ALP檢測(cè)結(jié)果顯示IL-31能夠抑制ALP的合成(P<0.05，圖3B)。Western blot結(jié)果顯示接受OVX手術(shù)的IL-31敲除小鼠BMSCs細(xì)胞的TGF-β1、Smad4磷酸化水平均顯著高于接受OVX手術(shù)的野生型小鼠組(圖3C)。

2.4IL-31對(duì)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1凋亡影響 MC3T3-E1細(xì)胞轉(zhuǎn)染IL-31 shRNA后，IL-31的mRNA水平顯著降低(圖4A)，MC3T3-E1細(xì)胞增殖加快(圖4B)、凋亡減少(圖4C)，TGF-β1和Smad4磷酸化水平升高(圖4D)。

表1 術(shù)后8周小鼠血清學(xué)指標(biāo)(n=15)Tab.1 Serum biomarker in mouse model in 8 weeks post-surgery(n=15)

圖2 小鼠股骨病理切片及脊柱骨密度比較Fig.2 Comparison of pathological sections of femur and spinal bone density

圖3 BMSCs的增殖、ALP合成、TGF-β1表達(dá)和Smad4激活檢測(cè)比較Fig.3 Comparison of BMSCs proliferation,ALP synthesis,TGF-β1 expression and Smad4 activation of BMSCs

圖4 IL-31對(duì)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-F1增殖和凋亡的影響Fig.4 Influence of IL-31 on proliferation and apoptosis of mice osteoblast MC3T3-E1

3 討論

近年來研究認(rèn)為，機(jī)體免疫系統(tǒng)能夠通過生理和病理過程調(diào)節(jié)骨骼重塑而介導(dǎo)骨質(zhì)疏松的發(fā)生，從而提出了骨質(zhì)疏松是一種慢性免疫性疾病的概念[6]。盡管骨密度降低與多種病理狀態(tài)有關(guān)，但衰老和雌激素缺乏被普遍認(rèn)為是骨質(zhì)疏松發(fā)生的兩個(gè)重要危險(xiǎn)因素[7]。但也有研究報(bào)道了血清中的部分細(xì)胞因子與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者可發(fā)現(xiàn)血清IFN-γ、IL-6和IL-17等細(xì)胞因子的升高[8]。而在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者的血清IL-31水平顯著高于健康人群，并且隨著骨質(zhì)疏松嚴(yán)重程度的增加，血清IL-31水平也明顯增加，提示IL-31水平的升高可能促進(jìn)骨質(zhì)疏松的發(fā)生和惡化。另外，通過骨質(zhì)疏松小鼠模型的建立，我們發(fā)現(xiàn)IL-31敲除小鼠骨質(zhì)疏松嚴(yán)重程度顯著低于野生型小鼠，提示抑制IL-31的生成和分泌能夠減緩骨質(zhì)疏松的進(jìn)展。

多種細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子參與骨質(zhì)疏松的發(fā)生進(jìn)展，其中一些因子受IL-31的調(diào)節(jié)。如IL-31與細(xì)胞膜上的受體形成受體配體復(fù)合物后能夠激活受體酪氨酸激酶，從而激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括STAT3、Akt、NF-κB、MAPK和PI3K等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[9]，而這些信號(hào)通路已被證實(shí)參與骨骼重塑和炎癥發(fā)生、介導(dǎo)破骨細(xì)胞增殖和活化、促進(jìn)成骨細(xì)胞衰老和凋亡[10]。也有研究表明，IL-31能夠通過免疫細(xì)胞分泌促炎因子(如IL-1β、IL-6)、趨化因子(如CXCL1、CXCL8、CCL2和CCL18等)和基質(zhì)金屬蛋白酶等，從而作用于破骨細(xì)胞而促進(jìn)其分化、趨化，并增強(qiáng)破骨細(xì)胞的功能而介導(dǎo)骨骼重塑發(fā)生，提示IL-31在促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化過程起到重要的作用[11]。

TGF-β1是細(xì)胞和組織中含量最豐富的TGF-β超家族成員。在骨代謝過程中，TGF-β能夠介導(dǎo)骨形成和骨吸收之間的偶聯(lián)，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的數(shù)量和活性，并刺激其增殖和分化，調(diào)節(jié)骨重建，維持骨代謝平衡[12]。另外，TGF-β1還能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡、抑制破骨細(xì)胞的增殖。骨質(zhì)疏松患者骨小梁內(nèi)TGF-β 含量下降，如果給予外源性TGF-β補(bǔ)充，可使骨形成增加、破骨細(xì)胞的破骨作用減弱[13]。而Smad蛋白家族是TGF-β細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，能夠通過與細(xì)胞核內(nèi)其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或直接調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄而介導(dǎo)TGF-β的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Smad4是TGF-β1各類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的共同介質(zhì)，磷酸化的Smad4是其活性形式，介導(dǎo)TGF-β1的信號(hào)傳遞[14]。在本研究中，通過原代BSMCs細(xì)胞和小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞的體外研究發(fā)現(xiàn)，抑制IL-31后能夠增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)TGF-β1的表達(dá)，并增強(qiáng)TGF-β1下游的Smad4的磷酸化從而促進(jìn)BSMCs細(xì)胞和MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖，并抑制凋亡發(fā)生，提示IL-31能夠通過反向調(diào)控成骨細(xì)胞內(nèi)的TGF-β1/Smad4通路來抑制成骨細(xì)胞的增殖和活性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)IL-31水平明顯升高，并且升高程度與骨質(zhì)疏松的嚴(yán)重程度相關(guān)。通過骨質(zhì)疏松小鼠模型和細(xì)胞學(xué)研究證實(shí)，IL-31的下調(diào)能夠活化TGF-β1/Smad4信號(hào)通路而增強(qiáng)成骨細(xì)胞增殖活力而抑制骨質(zhì)疏松發(fā)生。因此抑制患者IL-31水平可能是預(yù)防骨質(zhì)疏松形成或程度加重的潛在治療靶點(diǎn)。