趙軍華 周志杰 崔吉岡 倪靈凡 孟曉青
(洛陽(yáng)東方醫(yī)院呼吸腎病科,洛陽(yáng) 471003)
腎癌是最常見(jiàn)的10種癌癥之一,也是泌尿外科惡性腫瘤中最致命的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)2012年全世界新增腎癌病例33.8萬(wàn),腎癌死亡病例14.3萬(wàn)[1]。腎癌治療是一個(gè)全球性的醫(yī)學(xué)難題。大量文獻(xiàn)報(bào)道許多微小RNA(MicroRNA,miR)在腎癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[2]。MicroRNAs是在所有真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的短非編碼RNA,在幾乎所有的生物途徑中都扮演著重要的角色。MicroRNAs的異常表達(dá)常與包括癌癥在內(nèi)的各類(lèi)疾病密切相關(guān)[3]。越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明MicroRNAs在癌癥治療方面具有很大的潛力[4]。深入研究MicroRNAs在癌癥中的作用對(duì)人類(lèi)抗癌事業(yè)具有重要意義。據(jù)報(bào)道m(xù)iR-138-5p在非小細(xì)胞肺癌的耐藥性、胰腺癌細(xì)胞侵襲和遷移及鼻咽癌自噬方面具有重要作用[5-7]。但miR-138-5p在腎癌中的報(bào)道還十分罕見(jiàn),有待進(jìn)一步研究。本文的主要目的是探究miR-138-5p對(duì)人腎癌細(xì)胞GRC-1增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響及其分子機(jī)制。
1.1細(xì)胞系與主要試劑 人腎癌GRC-1細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection,ATCC)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Regent購(gòu)自賽默飛世爾科技公司。miR-138 mimic、缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia inducing factor,HIF)-1α過(guò)表達(dá)載體pc-HIF-1α以及含HIF-1α野生型和突變型的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒載體由上海Genepharm公司合成。熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。RNA提取試劑盒和定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM購(gòu)自大連TaKaRa公司。miRNA定量PCR試劑盒TaqMan miRNA Assay購(gòu)自Applied Biosystems公司。Transwell小室及人工基底膜購(gòu)自美國(guó)BD公司??笻IF-1α抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。
1.2方法
1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 腎癌GRC-1細(xì)胞培養(yǎng)于添加10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞增殖密度到約80%時(shí)進(jìn)行傳代。
1.2.2細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 GRC-1細(xì)胞機(jī)分為5組:對(duì)照(GRC-1)組、mimic-scramble組、miR-138 mimic組、HIF-1α過(guò)表達(dá)(pc-HIF-1α)組和共轉(zhuǎn)染(mimic+pc-HIF-1α)組。mimic-scramble為miR-138 mimic的陰性對(duì)照隨機(jī)序列。按照轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Regent說(shuō)明書(shū)將miR-138 mimic和pc-HIF-1α分別或者同時(shí)轉(zhuǎn)入GRC-1細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染 48 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.2.3熒光素酶分析 首先按照轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Regent說(shuō)明書(shū)將HIF-1α野生型或突變型的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒載體單獨(dú)轉(zhuǎn)入細(xì)胞中,或同時(shí)添加miR-138 mimic轉(zhuǎn)入細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后移去培養(yǎng)液。然后用洗滌液洗滌細(xì)胞,棄去洗滌液后向孔中加入1×的細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂解。室溫下振蕩器上振蕩5~10 min,再移入離心管中3 000 r/min 離心5 min,取上清進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)和儀器操作說(shuō)明對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行發(fā)光值測(cè)定。
1.2.4實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR) 首先用RNA提取試劑盒提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后用以下引物進(jìn)行qRT-PCR:miR-138-5p上游引物:5′-AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG-3′,miR-138-5p下游引物:5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;HIF-1α上游引物:5′-TT GCTCATCAGTTGCCACTTCC-3′,HIF-1α下游引物:5′-AGCAATTCATCTGTGCT TTCATGTC-3′。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè),用公式2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。
1.2.5蛋白印跡 各組待測(cè)細(xì)胞經(jīng)PBS清洗3次后加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白,100℃變性5 min。等量蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜。然后用5%的BSA封閉1 h,再加入抗HIF-1α的一抗,4℃過(guò)夜孵育。第2天加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照,并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。
1.2.6CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 首先用培養(yǎng)液將CCK-8溶液稀釋到10%濃度,然后用上述CCK-8稀釋液將待測(cè)細(xì)胞制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,最后檢測(cè)450 nm處吸光值,計(jì)算細(xì)胞增殖倍數(shù)。
1.2.7流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 收集各組待測(cè)細(xì)胞后用PBS洗滌3次,再用1×Binding buffer將細(xì)胞制成1×106個(gè)/ml的懸液。然后加入Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC),避光,輕輕地混勻,室溫孵育10 min。再加入碘化丙啶(Propidium Iodide,PI),避光,室溫孵育5 min。最后利用流式細(xì)胞儀對(duì)染色的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。
1.2.8Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 首先用無(wú)血清的培養(yǎng)液將各組待測(cè)細(xì)胞制成細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml的懸液,并將上述細(xì)胞懸液加入鋪有人工基底膜的Transwell的上室中,同時(shí)在下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24 h。然后用0.5%的結(jié)晶紫對(duì)上室底部細(xì)胞進(jìn)行染色,并用棉簽將上室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞除去。顯微鏡下觀(guān)察并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。
1.2.9劃痕實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移能力 將各組待測(cè)細(xì)胞制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,加入6孔板中。過(guò)夜培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞。然后在單層細(xì)胞上用10 μl 的槍頭劃?rùn)M線(xiàn),PBS洗3次,洗去因劃痕而脫落的細(xì)胞。顯微鏡下拍照測(cè)量劃痕寬度。培養(yǎng)24 h后再取出拍照測(cè)量劃痕寬度,計(jì)算劃痕愈合率。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)。P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1miR-138-5p靶向HIF-1α 通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-138-5p可靶向HIF-1α。利用熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-138-5p與HIF-1α的靶向關(guān)系。圖1顯示, HIF-1α野生型序列中與miR-138-5p互補(bǔ)的序列ACCAGC突變?yōu)閁GGUCG后,HIF-1α野生型與HIF-1α突變型細(xì)胞中熒光素酶活性不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在HIF-1α野生型中轉(zhuǎn)染miR-138 mimic后熒光素酶活性降低(P<0.01)。但在HIF-1α突變型細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-138 mimic后熒光素酶活性無(wú)明顯變化。上述結(jié)果表明,miR-138-5p可靶向HIF-1α。
2.2miR-138 mimic對(duì)人腎癌GRC-1細(xì)胞HIF-1α的mRNA水平的影響 向人腎癌GRC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-138 mimic后,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)miR-138表達(dá)及HIF-1α的mRNA水平。如圖2所示,miR-138 mimic組miR-138表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.01)。miR-138 mimic組HIF-1α的mRNA水平低于對(duì)照組(P<0.01)。由此可見(jiàn),miR-138 mimic可降低人腎癌GRC-1細(xì)胞HIF-1α的mRNA水平。
2.3miR-138對(duì)人腎癌GRC-1細(xì)胞HIF-1α的蛋白水平的影響 為進(jìn)一步分析miR-138表達(dá)與HIF-1α表達(dá)間的關(guān)系,將miR-138 mimic和pc-HIF-1α分別或者同時(shí)轉(zhuǎn)入GRC-1細(xì)胞后通過(guò)蛋白印跡檢測(cè)HIF-1α的蛋白水平。由圖3可知,miR-138 mimic組HIF-1α的蛋白水平低于對(duì)照組(P<0.01)。與對(duì)照組相比,pc-HIF-1α組HIF-1α的蛋白水平上升(P<0.01)。mimic+pc-HIF-1α組HIF-1α的蛋白水平低于pc-HIF-1α組(P<0.01)。以上結(jié)果說(shuō)明,miR-138負(fù)向調(diào)控人腎癌GRC-1細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)。
2.4miR-138-5p靶向HIF-1α對(duì)人腎癌GRC-1細(xì)胞增殖能力的影響 利用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力, 分析miR-138-5p 靶向HIF- 1α對(duì)人腎癌GRC-1細(xì)胞增殖能力的影響。圖4顯示,miR-138 mimic組細(xì)胞增殖倍數(shù)低于對(duì)照組(P<0.01)。與對(duì)照組相比,pc-HIF-1α組細(xì)胞增殖倍數(shù)升高(P<0.01)。mimic+pc-HIF-1α組細(xì)胞增殖倍數(shù)低于pc-HIF-1α組(P<0.01)。以上結(jié)果說(shuō)明,miR-138-5p靶向HIF-1α可降低人腎癌GRC-1細(xì)胞增殖能力。
圖1 熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-138-5p與HIF-1α的靶向關(guān)系Fig.1 Luciferase reporter assay verified targeting relationship between miR-138-5p and HIF-1α
圖2 qRT-PCR檢測(cè)miR-138表達(dá)及HIF-1α的mRNA水平Fig.2 Expression of miR-138 and mRNA level of HIF-1α were detected by Quantitative Real-time PCR
2.5miR-138-5p靶向HIF-1α對(duì)人腎癌GRC-1細(xì)胞凋亡的影響 為分析miR-138-5p靶向HIF-1α對(duì)人腎癌GRC-1細(xì)胞凋亡的影響,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。如圖5所示,miR-138 mimic組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組(P<0.01)。與對(duì)照組相比,pc-HIF-1α組細(xì)胞凋亡率下降(P<0.01)。mimic+pc-HIF-1α組細(xì)胞凋亡率高于pc-HIF-1α組(P<0.01)。由此可見(jiàn),miR-138-5p靶向HIF-1α可提高人腎癌GRC-1細(xì)胞凋亡能力。
2.6miR-138-5p靶向HIF-1α對(duì)人腎癌GRC-1細(xì)胞侵襲能力的影響 利用Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力,分析miR-138-5p靶向HIF-1α對(duì)人腎癌GRC-1細(xì)胞侵襲能力的影響。由圖6可知,miR-138 mimic組侵襲細(xì)胞數(shù)量低于對(duì)照組(P<0.01)。與對(duì)照組相比,pc-HIF-1α組侵襲細(xì)胞數(shù)量升高(P<0.01)。mimic+pc-HIF-1α組侵襲細(xì)胞數(shù)量低于pc-HIF-1α組(P<0.01)。上述結(jié)果表明,miR-138-5p靶向HIF-1α可降低人腎癌GRC-1細(xì)胞侵襲能力。
圖3 蛋白印跡檢測(cè)HIF-1α的蛋白水平Fig.3 Protein levels of HIF-1α were detected by Western blot
圖4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力Fig.4 Cell proliferation was detected by CCK-8
2.7miR-138-5p靶向HIF-1α對(duì)人腎癌GRC-1細(xì)胞遷移能力的影響 通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力,分析miR-138-5p靶向HIF-1α對(duì)人腎癌GRC-1細(xì)胞遷移的影響。圖7顯示,miR-138 mimic組劃痕愈合率低于對(duì)照組(P<0.01)。與對(duì)照組相比,pc-HIF-1α組劃痕愈合率上升(P<0.01)。mimic+pc-HIF-1α組劃痕愈合率低于pc-HIF-1α組(P<0.01)。以上結(jié)果說(shuō)明,miR-138-5p靶向HIF-1α可減弱人腎癌GRC-1細(xì)胞遷移能力。
圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡Fig.5 Cell apoptosis was detected by flow cytometry
圖6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力Fig.6 Transwell assay for cell invasion
圖7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力Fig.7 Cell migration was detected by scratch test
腎癌的傳統(tǒng)治療方法主要包括化療、根治性腎切除術(shù)、免疫療法等[8-10]。而在過(guò)去的15年里,隨著原發(fā)性腫瘤外科治療的進(jìn)展和對(duì)腎癌分子生物學(xué)和基因組學(xué)的認(rèn)識(shí)增加,腎癌治療研究發(fā)生了很大的變化,靶向治療在腎癌治療中受到了廣泛關(guān)注[11-13]。尋找合適的靶點(diǎn)對(duì)靶向治療至關(guān)重要。越來(lái)越多的研究表明MicroRNAs在細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移方面發(fā)揮著重要作用,具有成為靶向治療靶點(diǎn)的潛能。
細(xì)胞增殖的失控是癌細(xì)胞的主要特征之一,大量文獻(xiàn)報(bào)道MicroRNAs具有抗癌細(xì)胞增殖的功能。有數(shù)據(jù)顯示miR-106a*可靶向IRS-2減弱腎癌A498 細(xì)胞增殖[14]。有研究表明miR-335可通過(guò)負(fù)向調(diào)控BCL-W表達(dá)降低腎癌786-O 和 CaKi-1細(xì)胞增殖[15]。Xu等[16]發(fā)現(xiàn)miR-203可通過(guò)靶向FGF2抑制腎癌786-O細(xì)胞增殖。據(jù)報(bào)道m(xù)iR-138-5p可靶向FOXC1減弱胰腺癌細(xì)胞增殖[17]。另外,有研究發(fā)現(xiàn)miR-138-5p靶向PD-L1可抑制結(jié)腸直腸癌細(xì)胞增殖[18]。本文結(jié)果顯示,miR-138-5p靶向HIF-1α可降低人腎癌GRC-1細(xì)胞增殖能力。
癌細(xì)胞常常會(huì)出現(xiàn)異常的細(xì)胞凋亡,越來(lái)越多的研究表明MicroRNAs在誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著積極作用。據(jù)報(bào)道在腎癌ACHN和786-O細(xì)胞中miR-145可靶向ANGPT2和 NEDD9促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]。有研究顯示miR-646可靶向NOB1增加腎癌786-O細(xì)胞凋亡[20]。Ma等[21]發(fā)現(xiàn)miR-185可靶向VEGFA誘導(dǎo)腎癌ACHN和786-O細(xì)胞凋亡。有數(shù)據(jù)顯示miR-138-5p可靶向SIRT1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡[22]。據(jù)報(bào)道在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中miR-138-5p可靶向PDK1增加細(xì)胞凋亡[23]。與前人結(jié)果類(lèi)似,本研究結(jié)果顯示,miR-138-5p靶向HIF-1α可提高人腎癌GRC-1細(xì)胞凋亡。
癌細(xì)胞的侵襲能力在癌癥進(jìn)程中至關(guān)重要,大量數(shù)據(jù)表明MicroRNAs具有調(diào)節(jié)癌細(xì)胞侵襲的功能。有研究發(fā)現(xiàn)miR-141可通過(guò)調(diào)控EphA2表達(dá)抑制腎癌786-O和SN12-PM6細(xì)胞侵襲[24]。有數(shù)據(jù)顯示miR-34a可靶向CD44降低腎癌ACHN,786-O 和SN12PM6細(xì)胞侵襲[25]。據(jù)報(bào)道m(xù)icroRNA-145可靶向MMP-11減弱腎癌786-O 和A498細(xì)胞侵襲[26]。研究表明miR-138-5p靶向Survivin可降低膀胱癌細(xì)胞侵襲[27]。另外,Zhuang等[28]發(fā)現(xiàn)miR-138-5p還可直接靶向ΔNp63抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲。本文結(jié)果顯示,miR-138-5p靶向HIF-1α可減弱人腎癌GRC-1細(xì)胞侵襲能力。
細(xì)胞遷移能力的提高是癌癥擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ),越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道MicroRNAs在癌細(xì)胞遷移方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。有研究發(fā)現(xiàn)miR-204可通過(guò)負(fù)向調(diào)控SOX4降低腎癌786-O和A498細(xì)胞遷移[29]。有數(shù)據(jù)顯示,miR-182可靶向IGF1R減弱腎癌Caki-1細(xì)胞遷移[30]。有研究表明在胃癌細(xì)胞中miR-138-5p可靶向EGFR降低細(xì)胞遷移[31]。Xiao等[32]發(fā)現(xiàn)miR-138-5p可靶向YAP1抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移。據(jù)報(bào)道在骨肉瘤細(xì)胞中miR-138-5p還可通過(guò)靶向EZH2減弱細(xì)胞遷移[33]。本文結(jié)果顯示,miR-138-5p靶向HIF-1α可降低人腎癌GRC-1細(xì)胞遷移能力。
本研究表明,在人腎癌GRC-1細(xì)胞中,miR-138-5p可靶向HIF-1α;miR-138負(fù)向調(diào)控HIF-1α的表達(dá);miR-138-5p靶向HIF-1α可減弱細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力;并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。下一步計(jì)劃在腎癌動(dòng)物模型中研究miR-138-5p對(duì)腎癌發(fā)生發(fā)展的影響,為開(kāi)發(fā)有效的腎癌治療方法奠定基礎(chǔ)。