熊去氧膽酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞BEL-7404凋亡及其機(jī)制探究

尤梅桂，翁樂(lè)斌，吳雅茗

(1.廈門(mén)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建 廈門(mén) 361023；2.廈門(mén)醫(yī)學(xué)院機(jī)能與臨床轉(zhuǎn)化福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361023)

肝癌是世界排名第二的最常見(jiàn)腫瘤,因肝癌死亡的患者中中國(guó)占超過(guò)一半。因此中國(guó)作為肝癌高發(fā)的國(guó)家,對(duì)肝癌的診療迫在眉睫。熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)是名貴中藥熊膽所含的主要有效成分，是一種較為常用的治療原發(fā)性膽汁性肝硬化的藥物[1]。近年來(lái)大量的研究發(fā)現(xiàn)熊去氧膽酸還具有多樣的抗腫瘤活性，如誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化等，是一種較好的抗腫瘤候選藥物[2-3]。此外，UDCA對(duì)正常組織和細(xì)胞沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒作用。因此，本研究旨在探討UDCA誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞BEL-7404凋亡的作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人肝癌細(xì)胞BEL-7404來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640(杭州四季青生物工程材料有限公司)；小牛血清UDCA(標(biāo)準(zhǔn)品，含量99.99%，每支200 mg，Sigma產(chǎn)品)，陽(yáng)性對(duì)照藥氟尿嘧啶(FU,Santa Cruz產(chǎn)品)?？筩aspase-9兔抗體、抗survivin兔抗體、抗Bax兔抗體、抗Bcl-2小鼠抗體均購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司；抗procaspase-3兔抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)；MK3 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo公司)；SW-CJ-1D型醫(yī)用超凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；Olympus CX22生物顯微鏡(日本Olympus公司)等。

1.2 方法

1.2.1 增殖抑制試驗(yàn) 用適量0.25%胰酶消化處于對(duì)數(shù)期的人肝癌細(xì)胞BEL-7404，加入培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞加入96孔酶標(biāo)板中，每孔100 μL，設(shè)置3個(gè)副孔，置于37 ℃恒溫、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h左右。分別加入終濃度是20、6.66、2.22、0.75、0.25、0.08 mmol·L-1的目標(biāo)化合物UDCA，加入陽(yáng)性對(duì)照藥1.0 mmol·L-1FU，100 μL/孔。孵育72 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，輕輕晃勻，盡量除去氣泡。 孵育2.5 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(A)，A值越高活細(xì)胞數(shù)也越多。根據(jù)A可計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。

1.2.2 光鏡形態(tài)學(xué)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肝癌細(xì)胞BEL-7404懸液(約含2×105個(gè)細(xì)胞)，2 mL/孔接種于6孔板中，于接種后24 h分別加入不同濃度的UDCA(終濃度分別0.4、0.8、1.6 mmol·L-1)，每組3個(gè)孔，另設(shè)一組空白和一組1.0 mmol·L-1的FU作為陽(yáng)性對(duì)照。處理24 h后，置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)procaspase-3、9和survivin蛋白、Bax/Bcl-2 取UDCA組，陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照在作用48 h后的細(xì)胞，加入蛋白裂解液。離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至離心管中。電泳：配制10% SDS-PAGE膠，上樣。80 V濃縮膠，120 V分離膠，2.5～3 h，轉(zhuǎn)膜，封閉。抗體孵育：一抗用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)稀釋至工作液濃度，將各條膜置于皿中用PBST清洗3次，10 min/次。用PBST稀釋二抗至工作液濃度，1 500 μL/條。按前法封袋。37 ℃恒溫?fù)u床反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后剪開(kāi)袋口，棄二抗，PBST清洗3次，10 min/次，PBS清洗10 min。于Odyssey近紅外熒光掃描儀掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用mean±SD表示。應(yīng)用SPSS 11.0軟件分析，兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較釆用完全隨機(jī)的單因素(One-ANOVA)方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。若P<0.05表示與對(duì)照組相比具有差異，P<0.01表示與對(duì)照組相比有顯著差異，P>0.05，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 10 h對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7404的生長(zhǎng)抑制作用呈濃度-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系 如圖1所示，當(dāng)采用不同濃度的藥物(0.08、0.25、0.75、2.22、6.66、20 mmol·L-1)處理人肝癌細(xì)胞BEL-7404細(xì)胞24、48、72 h后，IC50分別為(0.83±0.097)、(0.79±0.088)、(0.67±0.071) mmol·L-1，細(xì)胞呈不同程度的抑制作用，且這種現(xiàn)象存在一定的藥物濃度-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。

2.2 光鏡觀察結(jié)果 空白對(duì)照組人肝癌細(xì)胞BEL-7404生長(zhǎng)狀態(tài)良好，多呈梭形，貼壁生長(zhǎng)，輪廓清晰，胞質(zhì)均勻透明，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密；隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)形態(tài)基本變化不大。UDCA處理后，細(xì)胞的形態(tài)、貼壁能力、集落性都有不同程度改變。隨著UDCA濃度的增大，細(xì)胞膜皺縮，細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞體積變小，活細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，細(xì)胞碎片也逐漸增多，部分細(xì)胞脫落、漂浮于培養(yǎng)液中。光鏡下觀察得出UDCA可以引起B(yǎng)EL-7404細(xì)胞凋亡。

2.3 Western blot結(jié)果 如圖2所示，Bcl-2蛋白表達(dá)減少且蛋白水平的變化呈一定的濃度依賴性(P<0.05)，Bax的表達(dá)變化不明顯(P>0.05)，Bax與Bcl-2蛋白的比率顯著增加，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞趨向凋亡狀態(tài)。通過(guò)Western blot定量的觀察UDCA對(duì)procaspase-3和survivin蛋白表達(dá)的影響。如圖3所示，與空白對(duì)照組相比，UDCA細(xì)胞在給予(0.4、0.8、1.6 mmol·L-1)后，procaspase-3、survivin蛋白表達(dá)減少，提示UDCA可能是通過(guò)survivin/smac線粒體信號(hào)通路激活caspase-3、survivin的表達(dá)。

圖1 UDCA不同時(shí)間不同劑量下對(duì)BEL-7404增殖抑制的比較

圖2 UDCA對(duì)Bax和Bcl-2蛋白的影響

圖3 UDCA對(duì) procaspase-3和survivin蛋白的影響

3 討論

Bcl-2存在于線粒體外膜，可中和Bax/Bax同源二聚體所誘導(dǎo)的凋亡作用。Bax作用于線粒體外膜形成孔道，改變胞膜的通透性，觸凋亡。決定細(xì)胞凋亡與否的關(guān)鍵是二者的比率，所以也將Bax和Bcl-2的比值稱為“凋亡開(kāi)關(guān)”[4]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，survivin具有腫瘤特異性，只表達(dá)于腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細(xì)胞的分化增殖及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究表明[5-6]survivin廣泛高表達(dá)于HepG2、Huh7和SK-Hep1等肝癌細(xì)胞系及人肝癌組織，與肝癌細(xì)胞凋亡調(diào)控密切相關(guān)。由于survivin蛋白主要作用機(jī)制是抑制凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)，從而降低了細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗性，抑制細(xì)胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)可以UDCA通過(guò)多途徑作用于肝癌細(xì)胞抑制肝癌細(xì)胞遷移和增殖。近UDCA抗癌的主要機(jī)制有：①升高促凋亡因子Bax，降低抗凋亡因子Bcl-2而誘導(dǎo)凋亡線粒體通路發(fā)揮抗肝癌細(xì)胞的作用[7]；②抑制凋亡抑制蛋白survivin的表達(dá)，增加caspase-3含量，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[8-9]；③抑制JAK-STAT3-COX-2，拮抗IL-6誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的增殖[10-11]。研究表明UDCA抗癌作用機(jī)制還可能與細(xì)胞增殖周期有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示UDCA能抑制BEL-7404增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并呈濃度、時(shí)間依賴性。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 UDCA對(duì)BEL-7404細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，并且隨UDCA濃度越高，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用越強(qiáng)。作用的時(shí)間越久，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用也越強(qiáng)。通過(guò)光鏡觀察，UDCA 可誘導(dǎo)BEL-7404細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。Western blot結(jié)果表明，UDCA可誘導(dǎo)Bcl-2蛋白表達(dá)下降，procaspase-3和survivin蛋白表達(dá)下降。該結(jié)果提示UDCA通過(guò)誘導(dǎo)Bax/Bcl-2水平升高，survivin蛋白表達(dá)下降，誘導(dǎo)BEL-7404細(xì)胞凋亡。

綜上所述，UDAC能夠抑制BEL-7404細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡，有望成為治療肝癌的候選藥物之一，其作用機(jī)制可能與激活procaspase-3引起B(yǎng)ax/Bcl-2表達(dá)上調(diào)，同時(shí)使得survivin蛋白表達(dá)下降，減低細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗性有關(guān)。