忍冬藤飲片標準煎液質量評價研究

范帥帥　田偉　王相　馮玉　李軍山　牛麗穎

摘要：目的 制備忍冬藤飲片標準煎液，并建立其質量控制方法。方法 按照標準煎液制備要求制備15批忍冬藤飲片標準煎液，以綠原酸、咖啡酸、馬錢苷作為定量檢測指標，計算出膏率、含量和轉移率，并建立超高液相色譜特征圖譜分析方法。結果 15批忍冬藤飲片標準煎液的出膏率范圍為6.44%～11.95%，綠原酸、咖啡酸、馬錢苷含量范圍分別為12.17～22.61 mg/g、2.75～5.12 mg/g、21.71～40.32 mg/g，轉移率范圍分別為28.13%～52.25%、53.93%～100.15%、40.04%～74.36%。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件進行分析和相似度評價，標定了10個共有特征峰，并指認綠原酸、咖啡酸、馬錢苷3個色譜峰。通過與對照圖譜比對，相似度均高于0.96。結論 本研究建立的忍冬藤飲片標準煎液的質量評價方法準確、穩(wěn)定、重復性良好，可為忍冬藤配方顆粒的質量控制提供參考。

關鍵詞：忍冬藤；飲片；標準煎液；配方顆粒；轉移率；出膏率；含量測定；特征圖譜

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2019）03-0082-06

Abstract： Objective To prepare standard decoction of Lonicerae Japonicae Caulis decoction pieces； To establish quality control method. Methods Fifteen batches of standard decoction of Lonicerae Japonicae Caulis decoction pieces were prepared according to the standardization method. With chlorogenic acid， caffeic acid and loganin as the detection indices， the extraction rate， content， and transfer rate were calculated and the UPLC characteristic chromatograms analysis method was established. Results According to the measurement of 15 batches of standard decoction of Lonicerae Japonicae Caulis decoction pieces， the extractum rate was at the range of 6.44%–11.95%. The contents of chlorogenic acid， caffeic acid and loganin were 12.17–22.61 mg/g， 2.75–5.12 mg/g and 21.71–40.32 mg/g， respectively. The transfer rates were 28.13%–52.25%， 53.93%–100.15% and 40.04%–74.36%， respectively. Besides， Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2012 edition） was used to analyze and compare the characteristic chromatograms. Ten common peaks were determined， and three chromatographic peaks of chlorogenic acid， caffeic acid， and loganin were identified. The similarity was over 0.96 by comparing with the control map. Conclusion This study establishes the quality control method of standard decoction of Lonicerae Japonicae Caulis decoction pieces， which is accurate， stable， and with good repeatability， which can provide references for the quality control of Lonicerae Japonicae Caulis formula granules.

Keywords： Lonicerae Japonicae Caulis； decoction pieces； standard decoction； formula granules； transfer rate； extractum rate； content determination； characteristic chromatogram

忍冬藤為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥莖枝[1]。始載于陶弘景《名醫(yī)別錄》：“今處處皆有，似藤生，凌冬不凋，故名忍冬?！比潭儆星鍩峤舛尽⑹栾L通絡的功效。忍冬藤在我國大部分地區(qū)有分布，很多地方已有栽培，其中以河南、山東的產(chǎn)量最大。研究表明，忍冬藤主要活性成分為有機酸類和環(huán)烯醚萜苷類[2-3]。綠原酸和咖啡酸具有一定的抗菌、抗感染作用[4]，在忍冬藤中含量較高，為其主要活性成分[5]；馬錢苷具有抗炎及調節(jié)免疫功能的作用[5]。三者的藥理活性能夠體現(xiàn)忍冬藤的功效。因此，以綠原酸、咖啡酸、馬錢苷為指標成分測定其含量，能更好地整體評價忍冬藤的內在質量。

標準煎液的制備遵循傳統(tǒng)煎液的煎煮原則，對工藝流程要求規(guī)范化和標準化，保證臨床用藥的準確性[6]。因此，本研究以水為溶媒，采用煎煮方式制備15批忍冬藤飲片標準煎液，對忍冬藤有效成分進行提取，通過測定綠原酸、咖啡酸、馬錢苷3個主要活性成分的含量、轉移率和出膏率的范圍，并以特征圖譜為主的整體質量控制方法建立15批忍冬藤標準煎液的UPLC特征圖譜，評價忍冬藤標準煎液的內在質量，為忍冬藤配方顆粒的質量控制和源于忍冬藤水煎液的制劑質量控制提供數(shù)據(jù)參考。

1 儀器與試藥

ACQUITY UPLC H-Class系統(tǒng)（PDA檢測器），美國沃特世公司；Empower3色譜工作站，美國沃特世公司；LC-15C高效液相色譜儀（SPD-15C型紫外檢測器、SIL-10AF自動進樣器、CTO-15C柱溫箱），日本島津公司；Pilot5-8L真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；TB-215D、BSA224S-CW電子分析天平，北京賽多利斯；JY10001型電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司；KQ-250型超聲波清洗器（功率250 W，頻率40 kHz），昆山市超聲儀器有限公司；RE-3000型旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；BJH-W200F型陶瓷自動中藥煲（電源220 V、50 Hz，功率300 W，容量2.0 L），廣東天際電器股份有限公司；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司。

綠原酸對照品（批號PY20170216，純度≥99%），南京普怡生物科技有限公司；咖啡酸對照品（批號110885-200102，純度≥99%），中國食品藥品檢定研究院；馬錢苷對照品（批號MUST-16080704，純度≥98%），成都曼思特生物科技有限公司；乙腈（Fisher化學試劑公司）、磷酸為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。15批不同產(chǎn)地忍冬藤飲片均由神威藥業(yè)集團有限公司提供，經(jīng)河北省藥品檢驗院孫寶惠主任藥師鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥莖枝，樣品來源見表1。

2 方法與結果

2.1 標準煎液的制備

取忍冬藤飲片100 g，使用煎藥壺煎煮2次。一煎加水10倍，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸20 min；二煎加水8倍，武火沸騰，文火保持微沸15 min。趁熱用200目篩網(wǎng)分離煎液，煎液迅速放入冷水浴中冷卻，合并2次煎液。60 ℃真空減壓濃縮至密度為1.00～1.02 g/mL，使用密度計和pH計測定流浸膏的密度和pH值，放入冰柜冷凍（-40 ℃）過夜，用冷凍干燥機干燥，得標準煎液干膏粉，計算出膏率。出膏率（%）=凍干粉質量÷飲片質量×100%，按2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則0800水分測定法第二法（烘干法）測定水分。結果見表2。以均值上下浮動30%來規(guī)定出膏率，15批忍冬藤飲片標準煎液出膏率為6.44%～11.95%。

2.2 綠原酸、咖啡酸和馬錢苷含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流動相A為0.3%磷酸，流動相B為乙腈，梯度洗脫（0～30 min，7%B；30～32 min，7%→10%B；32～50 min，10%B；50～51 min，10%→90%B；51～57 min，90%B；57～58 min，90%→7%B；58～65 min，7%B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：馬錢苷236 nm，綠原酸、咖啡酸327 nm；進樣量：5 ?L；柱溫：35 ℃。色譜圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液的制備

取綠原酸、咖啡酸、馬錢苷對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成每1 mL含34.6 ?g綠原酸、6.1 ?g咖啡酸和67.9 ?g馬錢苷的混合對照品溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備

取本品干膏粉適量，研細，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）10 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，即得忍冬藤標準煎液供試品溶液；取15批飲片粉末各約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，即得忍冬藤飲片供試品溶液。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 線性關系考察

精密吸取對照品溶液4、6、8、10、12、14 ?L，按上述色譜條件測定，以綠原酸進樣量為橫坐標，測定的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果表明綠原酸在0.138～0.484 ?g范圍內線性關系良好，回歸方程為：Y=1.991×106X+3.348×104，r=0.999 8；以咖啡酸進樣量為橫坐標，測定的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果表明咖啡酸在0.024～0.085 ?g范圍內線性關系良好，回歸方程為：Y=4.400×106X+1.419×104，r=0.999 7；以馬錢苷進樣量為橫坐標，測定的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果表明馬錢苷在0.271～0.950 ?g范圍內線性關系良好，回歸方程為：Y=1.433×106X+5.419×104，r=0.999 6。

2.2.4.2 精密度試驗

精密吸取對照品溶液5 ?L，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，綠原酸、咖啡酸、馬錢苷峰面積的RSD分別為1.04%、1.52%、1.19%，均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗

精密稱取標準煎液干膏粉約0.1 g，按供試品溶液制備方法制備。精密吸取供試品溶液5 ?L，按上述色譜條件分別于0、2、4、6、8、10 h進樣測定，綠原酸、咖啡酸、馬錢苷峰面積RSD分別為1.85%、1.68%、1.08%，結果表明，供試品溶液中綠原酸、咖啡酸、馬錢苷在10 h內穩(wěn)定。

2.2.4.4 重復性考察

精密稱取同一批樣品6份，每份約0.1 g，按供試品溶液制備方法制備，精密吸取供試品溶液5 ?L，按上述色譜條件進樣，計算得供試品溶液綠原酸、咖啡酸、馬錢苷總含量RSD=0.80%，結果表明，該方法重復性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗

取同一批樣品9份，研細，每份約0.05 g，精密稱定。精密加入一定體積的綠原酸、咖啡酸、馬錢苷對照品貯備液，按供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件測定，每份平行測定3次，結果表明該方法準確度良好，見表3。

2.2.5 樣品含量測定

采用上述方法測定15批忍冬藤飲片和標準煎液中綠原酸、咖啡酸、馬錢苷的含量，計算轉移率。結果見表4。以均值上下浮動30%規(guī)定綠原酸、咖啡酸、馬錢苷的含量和轉移率的變化范圍，綠原酸、咖啡酸、馬錢苷含量范圍分別為12.17～22.61 mg/g、2.75～5.12 mg/g、21.71～40.32 mg/g，轉移率范圍分別為28.13%～52.25%、53.93%～100.15%、40.04%～74.36%。

2.3 特征圖譜

2.3.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m）；流動相A為0.1%磷酸，流動相B為乙腈，梯度洗脫（0～4.5 min，95%→92%B；4.5～6 min，92%→91%B；6～8 min，91%→90%B；8～9 min，90%→89%B；9～12 min，89%B；12～12.1 min，89%→95%B；12.1～20 min，95%B）；流速0.3 mL/min；檢測波長238 nm；柱溫30 ℃；樣品室溫度8 ℃；進樣量1 ?L。

2.3.2 對照品溶液制備

取綠原酸、咖啡酸、馬錢苷對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成每1 mL含34.6 ?g綠原酸、6.1 ?g咖啡酸和67.9 ?g馬錢苷的混合對照品溶液，即得。選擇馬錢苷峰作為參照峰。

2.3.3 供試品溶液的制備

取干膏粉約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲（功率250 W，頻率35 kHz）10 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，即得。

表4 忍冬藤飲片和標準煎液中綠原酸、咖啡酸、馬錢苷含量及轉移率測定結果

編號 標準煎液含量/（mg/g） 飲片含量/（mg/g） 轉移率/%

綠原酸 咖啡酸 馬錢苷 綠原酸 咖啡酸 馬錢苷 綠原酸 咖啡酸 馬錢苷

S1 14.12 4.37 21.78 2.80 0.59 2.84 45.88 67.25 69.73

S2 13.60 4.23 21.12 3.17 0.52 3.87 43.34 82.87 55.10

S3 14.16 4.89 20.59 2.95 0.61 3.44 46.05 77.40 57.47

S4 11.24 3.10 29.72 2.98 0.39 5.18 32.45 67.62 49.34

S5 12.57 3.31 32.05 3.05 0.40 5.40 34.23 68.38 49.28

S6 14.01 4.05 34.96 2.99 0.50 5.73 44.10 76.75 57.33

S7 13.26 3.96 33.54 2.93 0.51 5.90 41.59 71.88 52.26

S8 12.88 4.02 32.03 3.16 0.48 5.54 38.70 80.13 54.95

S9 12.64 3.30 30.09 3.18 0.49 5.44 34.19 57.74 47.58

S10 27.85 4.07 36.32 7.25 0.43 6.19 34.55 84.28 52.79

S11 15.07 3.98 27.52 4.03 0.51 4.87 30.26 63.14 45.77

S12 33.74 3.90 40.49 8.19 0.43 6.36 42.45 92.82 65.58

S13 22.75 3.82 39.89 5.12 0.45 6.00 45.29 86.42 67.81

S14 22.52 4.37 35.98 4.83 0.44 4.87 37.73 80.15 59.80

S15 20.42 3.66 29.14 3.84 0.36 3.90 52.07 98.77 73.26

2.3.4 方法學考察

2.3.4.1 精密度試驗

精密吸取同一份供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.4.2 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一份供試品溶液，分別于制備后0、4、6、8、10、14 h進樣，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果RSD均小于3%，表明供試品溶液在14 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.4.3 重復性試驗

精密稱取同一批干膏粉樣品6份，按供試品溶液制備方法制備，精密吸取供試品溶液1 ?L，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果RSD均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 特征圖譜的建立

分別制備15批忍冬藤飲片、標準煎液的供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄15 min色譜圖，將所得色譜數(shù)據(jù)導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件，采用多點校正將譜峰自動匹配，中位數(shù)法計算得樣品特征圖譜的共有模式，結果見圖2、圖3。確定了15批忍冬藤標準煎液中10個共有峰，并指認峰4為綠原酸，峰5為咖啡酸，峰10為馬錢苷（S峰），見圖4。

2.3.6 指紋圖譜相關性分析

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》計算相似度，結果見表5。15批忍冬藤飲片特征圖譜的相似度均在0.95以上；15批忍冬藤標準煎液特征圖譜的相似度均在0.96以上，表明15批忍冬藤標準煎液有良好的相似性。比較忍冬藤飲片、標準煎液的特征圖譜，對共有峰進行分析可知，忍冬藤標準煎液10個特征峰在飲片中均能得到追蹤，表明忍冬藤標準煎液與飲片化學成分基本一致，見圖5。

3 討論

忍冬藤以莖枝入藥，為清熱解毒類中藥，不宜久煎，通過對煎煮時間和加水量的考察，并參考《醫(yī)療機構中藥煎藥室管理規(guī)范》（國中醫(yī)藥發(fā)〔2009〕3號），確認一煎加10倍水，煎煮20 min，二煎加8倍水，煎煮15 min；為了防止有效成分熱分解，盡可能保留原成分，本試驗采用《中藥飲片標準煎液研究策略》[6]分離和濃縮方法，對藥渣和藥液進行趁熱過濾、迅速冷卻及低溫減壓濃縮（溫度不超過60 ℃）處理；為盡可能去除藥液中的雜質，保證藥液的正常過濾，通過對分離藥渣和藥液的篩網(wǎng)進行考察，優(yōu)選出用200目篩網(wǎng)進行固液分離，最大限度達到與臨床湯劑一致的目的。

標準煎液以水為溶媒，在煎煮過程中藥效成分已被提取出來，因此采用超聲方式溶解即可。本試驗對提取溶媒和提取時間進行了考察，分別以50%甲醇、75%甲醇和100%甲醇作為提取溶媒，結果表明以50%甲醇提取較完全，故選用50%甲醇作為提取溶劑；選擇10、20、30 min進行提取時間考察，結果提取效率沒有差異，故選擇超聲10 min進行提取即可。

綠原酸、咖啡酸和馬錢苷是忍冬藤的主要活性成分，易溶于水、甲醇，標準煎液以水為提取溶媒，測定這3個成分的含量能夠更好地整體評價忍冬藤的內在質量。以其作為制劑的含量測定指標，采用中藥飲片標準煎液來標化忍冬藤不同用藥形式，可以提高臨床用藥的準確性和療效的一致性，對保證藥品質量具有實際意義。

本試驗基于HPLC和UPLC建立了忍冬藤飲片標準煎液的含量測定方法及特征圖譜方法，克服了單一成分信息量不全的缺點；忍冬藤標準煎液與飲片特征圖譜的主要色譜峰基本一致，其對照特征圖譜的相似度高達0.994以上，表明忍冬藤標準煎液與飲片主要化學成分基本等同，保證其質量的一致性，含量測定結合特征圖譜能夠較全面可靠地控制忍冬藤標準煎液的內在質量；方法學考察中，精密度、重復性、穩(wěn)定性的RSD均小于3%，表明此方法準確、可行、重復性良好。本研究可為忍冬藤配方顆粒的質量控制和評價提供可靠的數(shù)據(jù)參考。

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（收稿日期：2018-06-21）

（修回日期：2018-07-13；編輯：陳靜）