巴戟天微型飲片工藝優(yōu)選

魏曉峰　任曉航　李祥溦　劉博男　史輯　賈天柱

摘要：目的 優(yōu)選巴戟天微型飲片切制工藝參數(shù)，探討其是否適用于不同產(chǎn)地來源的巴戟天。方法 以蒸制時(shí)間、飲片長(zhǎng)度、飲片厚度、烘干溫度為影響因素，以水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸、甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素、耐斯糖的含量及出膏率、休止角為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選巴戟天微型飲片切制工藝，并建立不同產(chǎn)地來源巴戟天微型飲片HPLC指紋圖譜。結(jié)果 巴戟天微型飲片最佳切制工藝為：常壓蒸制軟化30 min，切片長(zhǎng)度3 mm，切片寬度1～2 mm，40 ℃烘干。結(jié)論 巴戟天微型飲片軟化切制工藝簡(jiǎn)單易行，具有良好的適用性。

關(guān)鍵詞：巴戟天；微型飲片；切制工藝；正交試驗(yàn)；高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：R283.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2019）03-0065-06

Abstract： Objective To optimize cutting process for Morindae Officinalis Radix miniature decoction pieces； To investigate whether the cutting technology was suitable for Morindae Officinalis Radix from different producing areas. Methods Steaming time， length of decoction pieces， thickness of decoction pieces， and drying temperature were set as influencing factors， and the contents of crystal lanolin， deacetyl levulinic acid， methyl isophorin-1-methyl ether， methyl isophorin， nes sugar， and the rate of ointment and angle of repose were set as evaluation indexes. The orthogonal test was used to optimize the cutting process of Morindae Officinalis Radix miniature decoction pieces， and HPLC fingerprints of Morindae Officinalis Radix miniature decoction pieces from different producing areas were established. Results The optimal cutting process for Morindae Officinalis Radix miniature decoction pieces was steaming 30 min， then cutting into 3 mm length and 1–2 mm width， and the drying temperature was 40 ℃. Conclusion The optimal cutting process for Morindae Officinalis Radix miniature decoction pieces is easy to conduct， with good applicability.

Keywords： Morindae Officinalis Radix； miniature decoction pieces； cutting process； orthogonal test； HPLC

飲片是中藥根據(jù)需要炮制處理而成的，可直接供臨床使用。飲片質(zhì)量好壞直接影響著中藥方劑、湯藥的臨床療效[1]。目前《中華人民共和國(guó)藥典》只對(duì)飲片的片、塊、絲、段、厚度等進(jìn)行了相關(guān)規(guī)定，并未對(duì)飲片片型、大小等具體參數(shù)進(jìn)行明確規(guī)定，因此飲片市場(chǎng)常遵循“以大為優(yōu)”的原則[2]。規(guī)格較大的飲片并不利于中藥有效成分煎出，反而導(dǎo)致臨床藥效不明顯。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，中藥湯劑煎煮服用方式已不能滿足患者的需求。市場(chǎng)上出現(xiàn)了諸如顆粒、超微、配方顆粒、單味浸膏顆粒、破壁[3]等多種形式的飲片，突破了傳統(tǒng)飲片攜帶不方便、煎煮費(fèi)時(shí)費(fèi)力的局限性，但以上多種飲片形式卻忽視了一個(gè)最重要環(huán)節(jié)——共煎過程，即根據(jù)中藥相須、相使、相惡、相殺、相畏、相反的“七情”配伍規(guī)律，多種化學(xué)成分之間的反應(yīng)均需在煎煮過程中完成，由此產(chǎn)生了微型飲片的概念。微型飲片是直徑在0.5～1.0 cm的丁塊狀飲片，其片型小于傳統(tǒng)飲片，煎出率高于傳統(tǒng)飲片[4]。我們期望通過微型飲片改革，制備出規(guī)格劃一、流動(dòng)可調(diào)，能夠智能配方的飲片，使中藥調(diào)劑接近西藥調(diào)劑，較傳統(tǒng)飲片更有利于有效成分煎出。

本研究以“四大南藥”之一的巴戟天為對(duì)象，對(duì)其微型飲片的軟化、切制工藝進(jìn)行優(yōu)選。巴戟天為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根，具有強(qiáng)筋骨、補(bǔ)腎陽、祛風(fēng)濕功效。臨床常用于筋骨萎軟、宮冷不孕、少腹冷痛、風(fēng)濕痹痛、月經(jīng)不調(diào)等癥[5]。巴戟天主要含有蒽醌、環(huán)烯醚萜苷、多糖、寡糖等類成分[6]。近年來，巴戟天由于其補(bǔ)腎壯陽[7]、抗衰老、防抑郁[8]、調(diào)節(jié)免疫[9]等作用，成為新藥研發(fā)的熱點(diǎn)。巴戟天主產(chǎn)于廣東、廣西、福建、海南等省，不同產(chǎn)地巴戟天由于加工工藝不同，導(dǎo)致其飲片性狀差異較大，形狀、長(zhǎng)度均不一致。因此，本研究采用正交試驗(yàn)對(duì)巴戟天微型飲片的軟化、切制工藝進(jìn)行研究，并建立不同產(chǎn)地來源的巴戟天微型飲片的特征圖譜，考察巴戟天微型飲片工藝的可行性。

1 儀器與試藥

E2695-2998型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；H-Class/Xevo TQD型三重四級(jí)桿液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有MassLynx色譜工作站），美國(guó)Waters公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（功率250 W，頻率40 kHz），昆山市超聲儀有限公司；AE240型1/10萬電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；HH-S4型水浴鍋，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

巴戟天藥材來自10個(gè)產(chǎn)地，分別為廣西玉林（S1）、廣西百色（S2）、廣東惠州（S3）、福建永定（S4）、廣東韶關(guān)（S5）、廣東梅州（S6）、廣東肇慶（S7）、福建南靖（S8）、廣東德慶（S9）、湖南湘西（S10），經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定，均為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根。

耐斯糖對(duì)照品（批號(hào)292-64121，純度≥99.0%，日本W(wǎng)ako公司），水晶蘭苷對(duì)照品（批號(hào)O0605AS，純度≥98.0%，大連美侖生物技術(shù)有限公司），去乙酰車葉草甘酸對(duì)照品（批號(hào)J0329AS，純度≥98.0%，大連美侖生物技術(shù)有限公司），甲基異茜草素-1-甲醚對(duì)照品（自制，純度>95.0%），甲基異茜草素對(duì)照品（自制，純度>95.0%），水為超純水，乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純（美國(guó)Merck公司），其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 耐斯糖含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取耐斯糖對(duì)照品1.2 mg，以甲醇-水（3∶97）定容至5 mL容量瓶中，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱取巴戟天微型飲片2 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加乙酸乙酯30 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，過濾，棄去濾液，濾渣揮干后加70%乙醇50 mL，相同條件下超聲處理，過濾，回收乙醇，殘?jiān)约状?水（3∶97）定容至25 mL容量瓶中，取續(xù)濾液，過0.22 ?m微孔濾膜，即得。

2.1.3 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m），負(fù)離子模式，流動(dòng)相為0.1%甲酸-乙腈∶0.1%甲酸-水，體積流量0.3 mL/min，梯洗脫程序見表1，進(jìn)樣量1 ?L。液相色譜-質(zhì)譜圖見圖1。

2.1.4 線性關(guān)系考察

精密吸取耐斯糖對(duì)照品0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL，進(jìn)樣，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=207 888X-1456.92，r?=0.999 1，線性范圍為0.004 8～0.240 0 mg。

2.1.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一耐斯糖供試品溶液，在1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，連續(xù)6 d同一時(shí)間分別進(jìn)樣1次，進(jìn)樣體積相同，測(cè)得耐斯糖日內(nèi)峰面積RSD=1.7%，日間峰面積RSD=1.7%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一耐斯糖供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，耐斯糖峰面積RSD=1.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品6份，制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下條件測(cè)定，測(cè)得耐斯糖含量RSD=1.9%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知耐斯糖含量的巴戟天微型飲片6份，每份1.0 g，按近似1∶1比例加入耐斯糖對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果耐斯糖平均加樣回收率為99.10%，RSD=1.73%。

2.1.9 樣品含量測(cè)定

取各組巴戟天微型飲片，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量1 μL，記錄峰面積，計(jì)算耐斯糖含量。

2.2 水晶蘭苷、去乙酰車葉草甘酸含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取水晶蘭苷、去乙酰車葉草甘酸對(duì)照品各1.5 mg，用80%甲醇定容至5 mL容量瓶中，搖勻，即得。用時(shí)按1∶1比例配成混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取巴戟天微型飲片1 g，置于150 mL具塞錐形瓶中，加80%甲醇100 mL，冷浸1 h，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）1 h，過濾，濾液減壓回收，用80%甲醇定容于10 mL容量瓶中，取續(xù)濾液，過0.45 ?m微孔濾膜，即得。

2.2.3 色譜條件

采用Venusil MP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫（5∶95→28.8∶71.2，15 min），檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm，體積流量0.8 mL/min，進(jìn)樣量2 ?L，柱溫25 ℃[10]。色譜圖見圖2。

2.2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸各2、4、6、8、10 ?L，進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果水晶蘭苷回歸方程為Y=2 000 000X-4430，r?=0.999 9，線性范圍為0.300～1.500 mg；去乙酰車葉草甘酸回歸方程為Y=2 000 000X+16 844，r?=0.999 9，線性范圍為0.300～1.500 mg。

2.2.5 樣品含量測(cè)定

取各組巴戟天微型飲片，按“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定，進(jìn)樣量2 ?L，記錄峰面積并計(jì)算水晶蘭苷和去乙酰車葉草甘酸的含量。

2.3 甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素對(duì)照品各2.93 mg，置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得。用時(shí)按1∶2比例配制成混合對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備

精密稱取巴戟天微型飲片5 g，置于150 mL圓底燒瓶中，加入80 mL氯仿，加熱回流提取2次，每次2 h，過濾，合并濾液，回收氯仿，以甲醇定容至10 mL量瓶中，取續(xù)濾液，過0.45 ?m微孔濾膜，備用。

2.3.3 色譜條件

采用Ecosil8色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水，梯度洗脫程序見表2，檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量20 ?L，柱溫30 ℃[11]。色譜圖見圖3。

2.3.4 線性關(guān)系考察

精密吸取甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素對(duì)照品各3、6、10、13、16 ?L，進(jìn)樣，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。甲基異茜草素回歸方程為Y=5 000 000X+4 000 000，r?=0.999 1，線性范圍為1.173～6.256 ?g；甲基異茜草素-1-甲醚回歸方程為Y=7 000 000X+4 000 000，r?=0.999 9，線性范圍為0.585～3.120 ?g。

2.3.5 樣品含量測(cè)定

取各組巴戟天微型飲片，按“2.3.2”“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定，進(jìn)樣量20 ?L，記錄峰面積并計(jì)算樣品中甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素的含量。

2.4 出膏率測(cè)定

取不同工藝制備的巴戟天微型飲片適量，粉碎，過2號(hào)篩，精密稱取4 g，置250 mL具塞錐形瓶中，精密加入100 mL水，冷浸，前6 h內(nèi)時(shí)時(shí)振搖，靜置18 h，用干燥濾器過濾，精密量取續(xù)濾液20 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，精密稱定。

2.5 飲片休止角測(cè)定

取一矩形盒子，裝滿巴戟天微型飲片，使其疏松程度適宜，逐漸傾斜盒子，使飲片開始流動(dòng)，此時(shí)傾斜程度即為飲片休止角θ，tanθ=H/L（H為傾斜角高，L為底邊）[12]。

2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用正交設(shè)計(jì)方法，以飲片長(zhǎng)度、飲片厚度、干燥溫度及蒸制時(shí)間為考察因素，每因素設(shè)置3個(gè)水平，用L9（34）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)（見表3）。以水晶蘭苷、去乙?；嚾~草甘酸、甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素、耐斯糖總含量（X）及出膏率（Y）、飲片休止角（Z）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并將其權(quán)重系數(shù)分別設(shè)定為0.4、0.4、0.2，進(jìn)行正交試驗(yàn)，計(jì)算綜合評(píng)分。綜合評(píng)分=0.4X/Xmax+0.4Y/Ymax+0.2Z/Zmax，其中Xmax、Ymax、Zmax為各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果的最大值。試驗(yàn)結(jié)果見表4，方差分析見表5。

由方差分析可知，蒸制時(shí)間和飲片厚度對(duì)巴戟天微型飲片切制工藝有顯著影響（P<0.05），切制長(zhǎng)度及烘干溫度無顯著影響。綜合直觀分析及方差分析結(jié)果，最終確定巴戟天微型飲片的最佳切制工藝為：常壓蒸制30 min后進(jìn)行切制，切片長(zhǎng)度3 mm、寬度1～2 mm，40 ℃烘干。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

取3批巴戟天微型飲片（樣品1、2、3號(hào)）和3份巴戟天傳統(tǒng)飲片（樣品4、5、6號(hào)），1、2、3號(hào)樣品按“2.6”項(xiàng)下確定的微型飲片切制工藝制備，4、5、6號(hào)樣品按傳統(tǒng)飲片切制工藝（加1.0倍量水于50 ℃悶潤(rùn)9 h，切段長(zhǎng)度10～15 mm）制備[10]，分別測(cè)量耐斯糖、水晶蘭苷、去乙酰車葉草甘酸、甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素的含量及出膏率、飲片休止角，計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見表6?？梢?，6份樣品綜合評(píng)分均較高，且微型飲片的綜合評(píng)分均高于巴戟天傳統(tǒng)飲片，與正交試驗(yàn)結(jié)果相吻合，表明巴戟天微型飲片最佳工藝穩(wěn)定可行。

2.8 指紋圖譜檢測(cè)方法

2.8.1 色譜條件

采用Ecosil8色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水，梯度洗脫程序見表2，檢測(cè)波長(zhǎng)277 nm，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量20 ?L，柱溫30 ℃。

2.8.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取甲基異茜草素-1-甲醚對(duì)照品2.93 mg，置于5 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得。

2.8.3 供試品溶液的制備

取不同產(chǎn)地巴戟天藥材100 g，按上述最佳切制工藝，分別常壓蒸制30 min后，切成切片長(zhǎng)度3 mm、寬度1～2 mm，40 ℃烘干，備用。精密稱取各巴戟天微型飲片2 g，置于150 mL圓底燒瓶中，分別加入80 mL氯仿，回流提取2次，每次2 h，過濾，合并濾液，回收氯仿，甲醇定容至10 mL容量瓶中，取續(xù)濾液，過0.45 ?m微孔濾膜，即得。

2.8.4 線性關(guān)系考察

精密吸取甲基異茜草素-1-甲醚對(duì)照品3、6、10、13、16 ?L，進(jìn)樣，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得甲基異茜草素-1-甲醚回歸方程Y=7 000 000X+4 000 000，r?=0.999 9，線性范圍為1.758～7.618 μg。

2.8.5 指紋圖譜的建立

HPLC圖譜采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A）》軟件，生成指紋圖譜共有模式，計(jì)算相似度。標(biāo)定共有峰，以甲基異茜草素-1-甲醚為參照峰，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。

2.8.6 指紋圖譜相似性評(píng)價(jià)

對(duì)不同產(chǎn)地巴戟天微型飲片進(jìn)行指紋圖譜測(cè)定，結(jié)果見圖4。以巴戟天傳統(tǒng)飲片色譜圖為參照譜，進(jìn)行自動(dòng)匹配并計(jì)算指紋圖譜相似度，結(jié)果見表7。相似度均在0.90以上。

2.8.7 指紋圖譜共有峰的標(biāo)定

以巴戟天最佳微型飲片中甲基異茜草素-1-甲醚（保留時(shí)間34.056 min）的平均峰面積為參考峰，計(jì)算不同產(chǎn)地巴戟天微型飲片各共有峰的相對(duì)峰面積。

通過不同產(chǎn)地來源的巴戟天指紋圖譜測(cè)試，共分離得到62個(gè)色譜峰，其中28個(gè)為共有色譜峰，與巴戟天傳統(tǒng)飲片色譜圖（見圖5）相比，共有峰增加且其相對(duì)峰面積明顯增大。進(jìn)一步說明巴戟天切制成微型飲片后，有效成分煎出率有所提高。

3 討論

本試驗(yàn)收集的10個(gè)不同產(chǎn)地巴戟天藥材均來自巴戟天主要產(chǎn)地，經(jīng)含量測(cè)定，均符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》巴戟天項(xiàng)下耐斯糖含量測(cè)定的相關(guān)規(guī)定（耐斯糖不得少于2.0%）。

切制是傳統(tǒng)中藥炮制工藝的一道重要工序，也是制備微型飲片最關(guān)鍵的工序[13]。為確定微型飲片的粒徑及厚度范圍，預(yù)試驗(yàn)中制備了不同粒徑、大小的飲片，并對(duì)其煎出液的有效成分含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)粒徑大小接近粉末的微型飲片在煎煮過程中極易糊鍋，不易過濾，因此確定飲片長(zhǎng)度范圍為3、5、7 mm，厚度范圍為1～2 mm、2～3 mm、3～4 mm。

2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)耐斯糖的含量進(jìn)行測(cè)定，由于檢測(cè)器的特殊性，限制其廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)采用超高效液相色譜-四極桿高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)耐斯糖的含量進(jìn)行考察，本方法更加快速、準(zhǔn)確。

休止角是評(píng)價(jià)飲片顆粒流動(dòng)性的指標(biāo)，也是采用自動(dòng)配方機(jī)調(diào)劑飲片時(shí)的必需參數(shù)。休止角<30°表明飲片流動(dòng)性好，休止角介于30°～40°表明飲片顆粒流動(dòng)性可以滿足調(diào)劑基本要求，休止角>40°表明飲片流動(dòng)性不好[14]。本試驗(yàn)制備的巴戟天微型飲片休止角均小于30°，符合飲片流動(dòng)性要求，有利于實(shí)現(xiàn)調(diào)劑的智能化、自動(dòng)化。

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（收稿日期：2018-07-03）

（修回日期：2018-07-20；編輯：陳靜）