響應(yīng)面優(yōu)化堿降解紅樹(shù)莓籽高聚原花青素 及對(duì)降血糖酶活性抑制作用

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(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013; 2.大連中超食品有限公司,遼寧大連 116400; 3.遼寧新大地實(shí)業(yè)發(fā)展集團(tuán)有限公司,遼寧沈陽(yáng) 110168)

紅樹(shù)莓屬薔薇科懸鉤子屬多年生灌木植物,又稱(chēng)覆盆子、托盤(pán)和馬林等,果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富,有“水果中的阿司匹林”美譽(yù)[1]。紅樹(shù)莓極不耐儲(chǔ)運(yùn),多加工成果汁、果酒及果醬等產(chǎn)品。紅樹(shù)莓加工副產(chǎn)物紅樹(shù)莓籽中富含黃酮、鞣花酸和原花青素等活性物質(zhì),但對(duì)其開(kāi)發(fā)利用較少,造成資源浪費(fèi)[2]。紅樹(shù)莓籽中原花青素是由黃烷-3-醇單體縮合成的聚多酚類(lèi)物質(zhì),聚合度在2～4間為低聚體,聚合度高于4為高聚體[3],具有抗氧化、降血糖及降血脂等功能,但其生物活性隨聚合度升高逐漸下降[4]。隨著人們生活水平提高,糖尿病患病率逐漸升高,現(xiàn)降糖藥物多為人工合成,工藝復(fù)雜,造價(jià)昂貴[5]。研究發(fā)現(xiàn)低聚原花青素對(duì)α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,α-Glu)和α-淀粉酶(α-amylase,α-Amy)活性具有抑制作用,避免蔗糖、麥芽糖及淀粉等分解為單糖,減緩餐后血糖升高[6-7],故將高聚原花青素降解具有一定必要性。

目前,高聚原花青素降解主要有酸、堿、氫化及生物酶等降解法。吳迪[8]通過(guò)酸法降解原花青素高聚體,平均聚合度由5.51降至2.6。施雅等[9]通過(guò)氫化降解將金蕎麥高聚原花青素平均聚合度由6.3降為2.2。蘇惠娟[10]采用N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶降解高聚原花青素,得到大量單體及二聚體。綜合比較,酸降解產(chǎn)量低,氫化降解安全性要求高,生物酶解菌種選取復(fù)雜。而堿法降解相對(duì)其它方法具有產(chǎn)量高、成本低及操作便捷等優(yōu)點(diǎn)[11],但其降解條件還需進(jìn)一步探索。本文通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化堿降解紅樹(shù)莓籽高聚原花青素工藝條件;其次,對(duì)紅樹(shù)莓籽高聚原花青素及其降解后的低聚原花青素進(jìn)行α-Amy和α-Glu酶活性抑制試驗(yàn),探究對(duì)兩種酶活性抑制作用,為其降血糖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅樹(shù)莓籽 大連中超食品有限公司;兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%) 如吉生物科技公司;阿卡波糖(≥98%) 北京索萊寶科技有限公司;氫氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、淀粉、香草醛、無(wú)水乙醇、冰乙酸、甲醇、石油醚 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;HPD100大孔樹(shù)脂、3,5-二硝基水楊酸、α-Glu(酶活30000 U/g)、α-Amy(酶活2000 U/g)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷 天津市光夏精細(xì)化工研究；以上試劑 均為分析純。

ALPHAI-2LDP plus真空冷凍干燥機(jī) 北京奧創(chuàng)興業(yè)有限公司;VICTOR X3酶標(biāo)儀 美國(guó) PerkinElmer公司;MicBio-II酶標(biāo)板恒溫振蕩器 合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;GT-100高通量研磨儀 北京格瑞德曼有限公司;UV-2700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津有限公司;BT-100恒流泵 上海青浦滬江西儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅樹(shù)莓籽原花青素提取及分級(jí) 紅樹(shù)莓籽研磨成粉過(guò)60目篩后,與石油醚以1∶10 (g/mL)混合,水浴50 ℃下脫脂4 h,抽濾后得紅樹(shù)莓籽脫脂粉。將此粉在乙醇濃度80%、料液比1∶15 (g/mL)、溫度50 ℃下提取1 h,抽濾取上清液,55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)醇味,真空冷凍干燥得原花青素粗提物。紅樹(shù)莓籽原花青素粗提物經(jīng)HPD100大孔樹(shù)脂吸附飽和后,40%乙醇初次洗脫得到低聚原花青素,再經(jīng)70%乙醇二次洗脫得到平均聚合度為5.44的高聚原花青素[8],冷凍干燥成粉備用。

1.2.2 高聚原花青素堿降解 參照蘇惠娟[10]方法略有更改,準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量1.2.1方法制備的紅樹(shù)莓籽高聚原花青素粉于試管中,按一定料液比分別加入一定濃度堿液,置于水浴中,在一定溫度及時(shí)間下降解后,0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至7.0,終止反應(yīng)。

1.2.3 堿降解單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 堿液種類(lèi)選擇 分別以氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉為降解液,在反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間40 min、堿液濃度3%、料液比1∶10 g/mL下,根據(jù)原花青素平均聚合度確定降解堿液。

1.2.3.2 料液比選擇 以亞硫酸鈉為降解液,在反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間25 min、堿液濃度3%下,考察料液比為1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 (g/mL)時(shí)高聚原花青素降解效果,根據(jù)原花青素平均聚合度確定料液比。

1.2.3.3 堿液濃度選擇 以亞硫酸鈉為降解液,在料液比1∶10 (g/mL)、反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間25 min下,考察堿液濃度為1%、2%、3%、4%、5%時(shí)高聚原花青素降解效果,根據(jù)原花青素平均聚合度確定堿液濃度。

1.2.3.4 反應(yīng)溫度選擇 以亞硫酸鈉為降解液,在料液比為1∶10 (g/mL),堿液濃度3%,反應(yīng)時(shí)間25 min下,考察反應(yīng)溫度為30、40、50、60、70 ℃時(shí)高聚原花青素降解效果,根據(jù)原花青素平均聚合度確定反應(yīng)溫度。

1.2.3.5 反應(yīng)時(shí)間選擇 以亞硫酸鈉為降解液,在料液比1∶10 (g/mL)、堿液濃度3%、反應(yīng)溫度60 ℃下,考察反應(yīng)時(shí)間為20、30、40、50、60 min時(shí)高聚原花青素降解效果,根據(jù)原花青素平均聚合度確定反應(yīng)時(shí)間。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化堿降解試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以料液比(A)、堿液濃度(B)、反應(yīng)溫度(C)、反應(yīng)時(shí)間(D)為因素,原花青素平均聚合度為響應(yīng)值,采用Design-Expert8.0.6軟件Box-Behnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 原花青素平均聚合度測(cè)定

1.2.5.1 原花青素質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線 稱(chēng)取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg,甲醇定容至25 mL,分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中,甲醇分別定容至1 mL,分別加入5 mg/mL香草醛-甲醇溶液6 mL和濃鹽酸3 mL,搖勻,30 ℃水浴避光1 h,以甲醇為空白,測(cè)定500 nm處吸光值[12],以?xún)翰杷刭|(zhì)量濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光值y為縱坐標(biāo),繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0012x-0.0028,R2=0.9993。

1.2.5.2 原花青素物質(zhì)的量標(biāo)準(zhǔn)曲線 稱(chēng)取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg,冰乙酸定容至25 mL,分別移取以上溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中,冰乙酸分別定容至1 mL,各加入5 mg/mL香草醛-乙酸溶液6 mL和濃鹽酸3 mL,30 ℃水浴避光反應(yīng)1 h,以冰乙酸為空白,測(cè)定500 nm處吸光值[8,10],以?xún)翰杷匚镔|(zhì)的量濃度x(μmol/mL)為橫坐標(biāo),吸光值y為縱坐標(biāo),繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=2.4899x-0.0063,R2=0.9995。

1.2.5.3 原花青素平均聚合度測(cè)定 堿降解得到的不同聚合度原花青素配制成1 mg/mL樣液,根據(jù)1.2.5.1和1.2.5.2方法得到原花青素質(zhì)量濃度及物質(zhì)的量,計(jì)算原花青素平均聚合度[12],見(jiàn)公式(1)。

式(1)

式中:m-原花青素質(zhì)量,μg;M-兒茶素相對(duì)分子質(zhì)量,290.27;n-原花青素物質(zhì)的量,μmol。

1.2.6 原花青素對(duì)α-Glu和α-Amy活性抑制試驗(yàn)

1.2.6.1α-Glu活性抑制測(cè)定 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量高聚原花青素及其降解后的低聚原花青素粉末,配制成濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的溶液,同時(shí)以阿卡波糖作為陽(yáng)性參照物,分別取上述不同濃度的溶液60 μL于96孔酶標(biāo)板中,各加入50 μL 0.2 U/mL的α-Glu,于酶標(biāo)板恒溫振蕩器中振蕩均勻后37 ℃下保溫10 min。再加入50 μL的5.0 mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷振蕩均勻后37 ℃下保溫20 min。最后,在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以緩沖溶液作空白,其它條件不變,測(cè)吸光度。每個(gè)樣品重復(fù)3次取平均值[13-14],抑制率計(jì)算見(jiàn)公式(2)。

式(2)

式中:AS-樣品在405 nm波長(zhǎng)處吸光度;A0-空白在405 nm波長(zhǎng)處吸光度。

1.2.6.2α-Amy活性抑制測(cè)定 分別取40 μL 1.2.6.1中配制的各濃度高聚原花青素、降解后的低聚原花青素及阿卡波糖溶液于25 mL試管中,并以等量磷酸鈉緩沖溶液做空白,加入200 μL 1.0 U/mL的α-Amy溶液,在37 ℃水浴中保溫10 min,加入400 μL 1.0 g/100 mL的可溶性淀粉于25 ℃反應(yīng)10 min。加入1.0 mL DNS試劑終止反應(yīng)。在沸水浴中加熱5 min后冷卻至室溫,加10 mL蒸餾水稀釋,在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度,抑制率計(jì)算同公式(2)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Word 2003軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理繪圖,SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(p=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿降解單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 堿液種類(lèi)對(duì)降解效果影響分析 堿液種類(lèi)對(duì)紅樹(shù)莓籽高聚原花青素降解效果如圖1所示,氫氧化鈉、碳酸氫鈉及亞硫酸氫鈉降解高聚原花青素,其平均聚合度差異不顯著(p>0.05);但與碳酸鈉和亞硫酸鈉平均聚合度差異顯著(p<0.05)。高聚原花青素降解后平均聚合度由低到高依次為亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉和碳酸鈉,亞硫酸鈉降解效果最佳,是因亞硫酸鈉溶液與其它堿液相比,水解后pH適中,促進(jìn)高聚原花青素末端C-C鍵斷裂,達(dá)到降解目的[11]。因此,選亞硫酸鈉為降解劑。

圖1 堿液種類(lèi)對(duì)降解效果影響Fig.1 Effects of alkali types on degradation注：不同小寫(xiě)字母表示組內(nèi)差異顯著, p<0.05;圖2～圖5,圖7～圖8同。

2.1.2 料液比對(duì)降解效果影響分析 料液比對(duì)紅樹(shù)莓籽高聚原花青素降解效果影響如圖2所示,料液比在1∶1～1∶10 (g/mL)內(nèi),原花青素平均聚合度顯著下降(p<0.05);料液比為1∶10 (g/mL)時(shí),降解效果最佳;隨后原花青素平均聚合度顯著升高(p<0.05),可能因高聚原花青素降解體系中隨堿液比例增大,體系中pH發(fā)生變化,當(dāng)料液比為1∶10 (g/mL)時(shí),體系pH適于高聚原花青素的降解[10]。因此,選取料液比為1∶10 (g/mL)。

圖2 料液比對(duì)降解效果影響Fig.2 Effects of ratio-liquid ratio on degradation

2.1.3 堿液濃度對(duì)降解效果影響分析 堿液濃度對(duì)紅樹(shù)莓籽高聚原花青素降解效果影響如圖3所示,堿液濃度1%～2%時(shí)平均聚合度顯著下降(p<0.05);堿液濃度為2%時(shí),高聚原花青素降解效果達(dá)最佳;堿液濃度2%～3%時(shí)差異不顯著(p>0.05);3%～5%時(shí)平均聚合度顯著升高(p<0.05),說(shuō)明亞硫酸鈉溶液濃度過(guò)大,不利于高聚原花青素降解。因此,選用堿液濃度為2%。

圖3 堿液濃度對(duì)降解效果影響Fig.3 Effects of liquor concentration on degradation

2.1.4 反應(yīng)溫度對(duì)降解效果影響分析 反應(yīng)溫度對(duì)紅樹(shù)莓籽高聚原花青素降解效果影響如圖4所示,溫度在30～50 ℃時(shí)平均聚合度略有降低,但差異不顯著(p>0.05)。溫度在50～60 ℃時(shí)平均聚合度顯著下降(p<0.05),可能此溫度下,亞硫酸鈉溶解度較大,與底物反應(yīng)更加充分。溫度在60～70 ℃時(shí)平均聚合度顯著升高(p<0.05),是因裂解的原花青素單體在過(guò)高溫下發(fā)生氧化聚合反應(yīng)[10]。故選取反應(yīng)溫度為60 ℃。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)降解效果影響Fig.4 Effects of reaction temperature on degradation

2.1.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)降解效果影響分析 反應(yīng)時(shí)間對(duì)紅樹(shù)莓籽高聚原花青素降解效果影響如圖5所示,降解20～30 min時(shí)平均聚合度降低趨勢(shì)不顯著(p>0.05),降解30～40 min時(shí)平均聚合度顯著下降(p<0.05),隨后平均聚合度逐漸升高,是因降解劑與底物反應(yīng)需要一定時(shí)間,且時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)反應(yīng)不利。故選擇反應(yīng)時(shí)間為40 min。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)降解效果影響Fig.5 Effects of reaction time on degradation

2.2 堿降解工藝優(yōu)化

2.2.1 模型建立與顯著性分析 根據(jù)表1確定的響應(yīng)面因素與水平,利用Design Expert-8.0.6軟件,通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)得到29組堿降解試驗(yàn),中心點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次,結(jié)果見(jiàn)表2。利用響應(yīng)面軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ突貧w系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果,見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 根據(jù)回歸方程得到圖6中各因素交互作用的等高線和響應(yīng)面圖,響應(yīng)面圖較直觀地反映了各自變量對(duì)原花青素平均聚合度的影響,如響應(yīng)曲面坡度越陡峭,等高線圖中橢圓越扁,表明因素對(duì)平均聚合度影響較大,即影響顯著,反之不顯著[15]。根據(jù)等高線圖和響應(yīng)面圖形狀,可分析兩兩因素對(duì)紅樹(shù)莓籽原花青素平均聚合度交互作用的影響。圖6a1和6a3中響應(yīng)面圖坡度陡峭,圖6b1和6b3等高線圖均略扁,故交互項(xiàng)AB和AD對(duì)高聚原花青素降解效果影響顯著;圖6a2中響應(yīng)面圖坡度陡峭,但圖6b2中等高線較橢且較密集,圖6a4、6a5和6a6中響應(yīng)面圖坡度較陡峭,圖6b2、6b4、6b5和6b6等高線圖均呈橢圓,且等高線密集,故交互項(xiàng)AC、BC、BD和CD對(duì)高聚原花青素降解效果影響均極顯著,與模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。由圖6a1、6a2、6a3、6a4、6a5和6a6可知,當(dāng)其它因素取零水平時(shí),隨料液比、堿液濃度、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間單一變量的增大,原花青素平均聚合度均呈先升高后降低趨勢(shì),故在所選因素參數(shù)范圍內(nèi)均存在極值,可對(duì)紅樹(shù)莓籽高聚原花青素降解最佳工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)。由圖6的響應(yīng)面圖和等高線圖及F值可知兩因素對(duì)高聚原花青素降解效果影響大小依次為:BC>AC>BD>CD>AB>AD。

圖6 各因素交互作用響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.6 Responese surface and contour plots注：a1～a6是各因素響應(yīng)面圖；b1～b6是各因素等高線圖。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析 通過(guò)響應(yīng)面模型確定原花青素降解最佳條件:亞硫酸鈉濃度2.13%、料液比1∶10.25 g/mL、降解時(shí)間41.44 min、反應(yīng)溫度60.12 ℃,原花青素平均聚合度理論值為2.12?？紤]實(shí)際操作條件,將降解工藝條件修正為:亞硫酸鈉濃度2.13%、料液比1∶10.25 g/mL、反應(yīng)時(shí)間42 min、反應(yīng)溫度60 ℃,此條件下進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn),原花青素平均聚合度為(2.14±0.11)<4,即為低聚原花青素,相對(duì)誤差1.43%<5%,說(shuō)明經(jīng)過(guò)該響應(yīng)面優(yōu)化得到的高聚原花青素降解工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 原花青素對(duì)α-Glu和α-Amy活性抑制結(jié)果分析

2.3.1 對(duì)α-Glu活性抑制結(jié)果分析 如圖7所示,隨阿卡波糖、低聚及高聚原花青素質(zhì)量濃度增大,α-Glu抑制率均顯著升高(p<0.05),質(zhì)量濃度越高,酶活抑制性越好,可能是因阿卡波糖、低聚及高聚原花青素降低了α-Glu活性,使其水解硝基苯-β-D-葡萄糖醛酸苷為對(duì)硝基苯酚能力降低[16];阿卡波糖、低聚及高聚原花青素對(duì)α-Glu的IC50分別為0.338、0.291和0.730 mg/mL。低聚原花青素對(duì)α-Glu活性抑制效果遠(yuǎn)強(qiáng)于高聚原花青素,略高于阿卡波糖,說(shuō)明高聚原花青素降解后得到的低聚原花青素對(duì)α-Glu活性抑制效果明顯提高,且與阿卡波糖抑制效果相似,具有一定降糖功效。

圖7 紅樹(shù)莓籽原花青素對(duì)α-Glu活性抑制Fig.7 Inhibitory effect of red raspberry seeds proanthocyanidins on the activity of α-Glu

2.3.2 對(duì)α-amy活性抑制作用結(jié)果分析 圖8所示,隨阿卡波糖、低聚及原花青素濃度增大,對(duì)α-Amy活性抑制效果顯著升高(p<0.05),是因α-Amy活性被抑制,進(jìn)而抑制淀粉水解為還原糖[17-18]。阿卡波糖、低聚及高聚原花青素對(duì)α-Amy的IC50分別為0.354、0.342和0.578 mg/mL。高聚原花青素對(duì)α-Amy活性抑制效果較低,低聚原花青素及阿卡波糖濃度低于0.4 mg/mL時(shí),低聚原花青素抑制效果高于阿卡波糖,但濃度高于0.4 mg/mL后,抑制效果低于阿卡波糖,整體抑制效果與阿卡波糖效果相近,說(shuō)明降解得到的低聚原花青素活性更高,可通過(guò)抑制α-Amy活性,減少淀粉被人體消化吸收,抑制餐后血糖水平的升高。

圖8 紅樹(shù)莓籽原花青素對(duì)α-Amy活性抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of red raspberry seeds proanthocyanidins on the activity of α-Amy

3 結(jié)論

紅樹(shù)莓籽脫脂后,經(jīng)提取和分級(jí)純化得到高聚原花青素,通過(guò)單因素試驗(yàn)確定高聚原花青素降解劑為亞硫酸鈉,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,確定最佳降解條件:堿液濃度2.13%、料液比1∶10.25 g/mL、反應(yīng)時(shí)間42 min、反應(yīng)溫度60 ℃,此條件下原花青素平均聚合度為2.14±0.11,屬低聚原花青素。高聚原花青素降解前后體外降血糖活性比較表明,降解后的低聚原花青素對(duì)α-Glu和α-Amy活性抑制效果更強(qiáng),阿卡波糖、低聚及高聚原花青素對(duì)α-Glu的

IC50分別為0.338、0.291和0.730 mg/mL,對(duì)α-Amy的IC50分別為0.354、0.342和0.578 mg/mL,高聚原花青素降解提高了其利用率,對(duì)α-Glu和α-Amy抑制效果大幅度增強(qiáng),且低聚原花青素抑制效果與阿卡波糖相近,為新型降血糖藥物開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。