兩種黃酮類(lèi)銅(II)配合物的 制備及體外抗氧化活性

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(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院,廣東廣州 510642)

天然黃酮化合物是自然界中一類(lèi)重要的微量營(yíng)養(yǎng)物。這類(lèi)化合物以黃酮母核為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),通過(guò)在環(huán)(A,B和C環(huán))上不同位置發(fā)生羥基等活性基團(tuán)取代而形成一系列結(jié)構(gòu)相似的衍生物[1]。黃酮化合物因具有清除體內(nèi)自由基、抗癌、抗病毒、抗菌、消炎等活性而具有重要的藥用價(jià)值,尤其是作為天然抗氧化劑，可將活潑、有害的自由基還原成穩(wěn)定、無(wú)害的物質(zhì)[2-3]。

金雀異黃酮和山奈酚作為常見(jiàn)的黃酮類(lèi)化合物,因具備豐富的生物活性而被廣泛使用,但在實(shí)際的工業(yè)生產(chǎn)中仍然存在許多不足,比如作用位點(diǎn)較多、選擇性和穩(wěn)定性不強(qiáng)、溶解度和生物利用度低等,這些缺點(diǎn)嚴(yán)重限制了此類(lèi)黃酮化合物的高效利用。人們?yōu)榱颂岣唿S酮化合物的生物活性,改善其溶解性和生物利用度,通常采用酯化、甲基化或引用親水基團(tuán)等進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾[4],或者是利用黃酮化合物中含有孤對(duì)電子的羥基氧和羰基氧與金屬離子配位形成金屬配合物[5],從而增強(qiáng)配體的生物活性或產(chǎn)生新功能[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金雀異黃酮 分析純，阿拉丁試劑有限公司；山奈酚 分析純，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇、雙氧水、乙二胺四乙酸 分析純，廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)；二甲基亞砜(DMSO) 分析純，天津市博迪化工有限公司；氯化銅、水楊酸、四甲基乙二胺、高氯酸、六次甲基四胺 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)；硫酸亞鐵 分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸、氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT) 生物試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；核黃素 生物試劑，上海伯奧生物科技有限公司。

78HW-1磁力攪拌器 金壇市江南儀器廠(chǎng);FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) Mettler Toledo有限公司;ACATAR 360 FT-IR型紅外光譜儀(KBr壓片) 美國(guó)Nnicolet公司;Pharmacia UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司;Vario EL元素分析儀 德國(guó)Elementar公司;STA 409 PC/PG 熱分析儀 德國(guó)Netzsch公司;721型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;HK-1D超級(jí)恒溫水槽 南京大學(xué)物理研究所;SYC-15B超級(jí)恒溫水浴 南京桑力電子設(shè)備廠(chǎng);SXL-1008程控式電爐 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 兩種配合物的合成 參考文獻(xiàn)方法[7],分別稱(chēng)取0.0676 g金雀異黃酮和0.0716 g山奈酚并置于2個(gè)150 mL圓底燒瓶中,各加入10 mL無(wú)水乙醇,用磁力攪拌器40 ℃下加熱攪拌,使固體完全溶解,然后分別加入等物質(zhì)的量的氫氧化鈉,繼續(xù)攪拌30 min;再向溶液中滴加0.5 mL 0.5 mol/L的氯化銅溶液,并加入去離子水至溶液總體積為20 mL,60 ℃下攪拌4 h。溶液靜置12 h,分別有黃綠色和深褐色沉淀生成,過(guò)濾,固體產(chǎn)物分別經(jīng)水和無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次,將其置于真空干燥器中室溫干燥2 d,樣品管密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 配合物中的元素含量分析 配合物1和2中的C、H元素含量采用德國(guó)元素分析儀測(cè)定。銅離子含量利用EDTA絡(luò)合滴定法測(cè)定[8]:稱(chēng)取0.2 g配合物于坩堝中,900 ℃下灼燒至完全分解,用HClO4溶解灼燒殘留物并定容至100 mL,加入六次甲基四胺調(diào)節(jié)溶液的pH至5～5.5,以二甲酚橙為指示劑,用0.0100 mol/L EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,實(shí)驗(yàn)平行三次。銅離子含量的計(jì)算公式為:

式(1)

式中:CEDTA為EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)的量濃度,mol/L;VEDTA為滴定過(guò)程中所用的EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,mL;MCu=63.55,為銅的相對(duì)原子質(zhì)量。

1.2.3 配體及配合物的紅外光譜測(cè)定 采用KBr壓片法,在400～4000 cm-1范圍內(nèi),運(yùn)用紅外光譜儀測(cè)定了配體金雀異黃酮、山奈酚和配合物1和2的紅外光譜。

1.2.4 配體及配合物的電子吸收光譜測(cè)定 在200～600 nm內(nèi),運(yùn)用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)分別測(cè)定了金雀異黃酮、山奈酚以及配合物1和2的電子吸收光譜。

1.2.5 配合物的熱重分析 采用熱分析儀,在氬氣保護(hù)下，分別測(cè)定了配合物1和2的熱分解,溫度工作范圍為25～750 ℃,升溫速率為10 ℃/min。

1.2.6 配合物的抗氧化活性測(cè)定

空白反應(yīng)液的配制:稱(chēng)取0.0381 g NBT溶于10 mL PBS緩沖溶液(5.800 g十二水合磷酸氫二鈉和0.593 g二水合磷酸二氫鈉溶解于水中,定容至100 mL,pH為7.4)中,得到溶液a;準(zhǔn)確稱(chēng)取0.0032 g核黃素(VB2)溶于100 mL PBS緩沖溶液中,得到溶液b;取1 mL四甲基乙二胺用PBS緩沖溶液定容至100 mL,得到溶液c。取20 mL溶液b和382 μL溶液c于500 mL容量瓶中,加入5 mL溶液a混合定容,得空白反應(yīng)液,避光保存。

1.2.6.2 水楊酸法測(cè)定配合物清除·OH活性 參考文獻(xiàn)[10],根據(jù)經(jīng)典的Fenton反應(yīng)體系,準(zhǔn)確配制9.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液,9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液,8.8 mmol/L過(guò)氧化氫儲(chǔ)備溶液。分別移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和1 mL的銅(II)配合物溶液于(溶液濃度為1.0×10-3mol/L)比色管中,然后依次加入0.5 mL硫酸亞鐵溶液,0.5 mL水楊酸-乙醇溶液,0.5 mL雙氧水溶液,1 mL DMSO,總體積用去離子水定容至5.0 mL,配合物的最終濃度梯度為2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5、1×10-4和2×10-4mol/L。充分混勻后于37 ℃水浴中恒溫30 min。在510 nm處測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度值,測(cè)定重復(fù)三次。清除率計(jì)算公式為:

式(2)

式中:A0為空白對(duì)照溶液的吸光度,Ax為加樣品后溶液的吸光度,Ax0為不加 H2O2的溶液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 配合物的元素分析結(jié)果

配合物1和2的元素分析結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測(cè)出金雀異黃酮和山奈酚與氯化銅均以2∶1的摩爾比形成目標(biāo)配合物。配合物1可能的分子式為C30H28O15Cu,C、H含量測(cè)定結(jié)果分別為C：52.23%(52.06%,理論值),H:3.84%(4.08%,理論值),銅離子含量為9.42%(9.19%,理論值);配合物2可能的分子式為C30H25O15.5Cu,C、H含量測(cè)定結(jié)果分別為C:51.81%(51.69%,理論值),H:3.92%(3.62%,理論值),銅離子含量為9.33%(9.12%,理論值)。

表1 配合物1和2的組成及元素分析Table 1 Elemental analysis of complexes 1 and 2

2.2 配合物的紅外光譜分析

配體及配合物1和2的紅外光譜如圖1所示,主要紅外數(shù)據(jù)列于表2。配體和配合物在3300～3500 cm-1均出現(xiàn)了一個(gè)寬峰,歸屬為黃酮母核上羥基的伸縮振動(dòng)。在1600～1700 cm-1,配合物1和2均出現(xiàn)了羰基伸縮振動(dòng)峰,相對(duì)于對(duì)應(yīng)的配體,配合物中的羰基伸縮振動(dòng)峰向低波數(shù)移動(dòng),原因是羰基上的氧原子與銅(II)配位后,使得羰基成鍵電子密度更加偏向氧原子,造成C=O鍵電子云密度下降,從而降低了羰基的雙鍵性[11],這說(shuō)明黃酮母核C環(huán)上的4位羰基氧與銅(II)配位。配體黃酮母核C環(huán)上的C=C的伸縮振動(dòng)峰在1500～1650 cm-1,而在配合物中C=C伸縮振動(dòng)峰向低波數(shù)移動(dòng)了10～20 cm-1,歸因于銅(II)與羰基配位后擴(kuò)大了C環(huán)的π鍵離域范圍。在1200～1300 cm-1,羥基峰的強(qiáng)度明顯減弱,并且伴有藍(lán)移,再次證明配合物中羥基數(shù)目減少,有部分羥基參與了配位。另外,在613、630 cm-1處出現(xiàn)了Cu-O鍵的伸縮振動(dòng)吸收[12]。

表2 配體及配合物1和2的主要紅外數(shù)據(jù)(cm-1)Table 2 IR spectra(cm-1)of the ligands and complexes 1 and 2

圖1 配體及配合物的紅外圖譜Fig.1 IR spectra of the ligands and complexes

2.3 配合物的電子吸收光譜分析

配體及配合物的電子吸收光譜如圖2所示。在配體和配合物1和2的電子吸收光譜中,均有兩個(gè)主要的特征譜帶Band Ⅰ和Band Ⅱ,其中,Band Ⅰ歸屬為黃酮母核B環(huán)上的π→π*電子躍遷,Band Ⅱ歸屬為A環(huán)上的π→π*電子躍遷[13]。通過(guò)與配體的譜帶進(jìn)行對(duì)比,目標(biāo)配合物的兩條譜帶均發(fā)生了不同程度的紅移。在金雀異黃酮和配合物1中,Band Ⅰ由332 nm紅移至389 nm,Band Ⅱ由262 nm紅移至266 nm;在山奈酚和配合物2中,Band Ⅰ由367 nm紅移至417 nm,Band Ⅱ由267 nm紅移至280 nm。這些譜帶的紅移主要是因?yàn)樾纬傻男买檄h(huán)使得整個(gè)分子的離域體系重新進(jìn)行電子分布,形成能量更低,范圍更廣的π電子離域系統(tǒng)[14]。

圖2 配體及配合物的電子吸收光譜Fig.2 Electronic absorption spectra of the ligands and complexes

2.4 配合物的熱重分析

配合物的熱重分析如圖3所示。結(jié)果表明,在配合物1中,從室溫到315 ℃共有2個(gè)明顯的失重過(guò)程,分別對(duì)應(yīng)于結(jié)晶水和配位水的失重,其中第一個(gè)失重過(guò)程的失重率為8.45%,推測(cè)配合物1含有3個(gè)結(jié)晶水(理論值為7.81%);第二個(gè)失重過(guò)程的失重率為5.35%,推測(cè)含有2個(gè)配位水(理論值為5.65%);315 ℃以后,配體金雀異黃酮開(kāi)始逐步分解,最終殘留物為氧化銅和部分碳的混合固體。配合物2與配合物1發(fā)生了類(lèi)似的熱分解過(guò)程。在配合物2中,從室溫到327 ℃同樣有2個(gè)明顯的失重過(guò)程,分別對(duì)應(yīng)于結(jié)晶水和配位水的失重,其中結(jié)晶水的失重率為3.65%,推測(cè)含有1.5個(gè)結(jié)晶水(理論值為3.88%);配位水的失重率為5.15%,推測(cè)含有2個(gè)配位水(理論值為5.38%);327 ℃以后,配體山奈酚開(kāi)始逐步分解,最終殘留物為氧化銅和部分碳的混合固體。

圖3 配合物的熱重分析Fig.3 Thermogravimetric analysis of the complexes

綜合上述配合物的元素分析、紅外光譜、電子吸收光譜和熱重分析測(cè)定結(jié)果,結(jié)合參考文獻(xiàn)[15-16],可推測(cè)配合物1和2的分子式分別為[Cu(Gen)2(H2O)2]·3H2O(1)和[Cu(Kae)2(H2O)2]·1.5H2O(2),可能的分子結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖4 配合物可能的分子結(jié)構(gòu)Fig.4 The possible molecular structure of the complexes

2.5 配合物的抗氧化活性分析

圖5 配合物對(duì)的清除率Fig.5 The scavenging ratios of the complexes to superoxide anion radicals

2.5.2 水楊酸法測(cè)定配合物清除·OH活性 ·OH是最活躍、進(jìn)攻性最強(qiáng)的活性氧(ROS)自由基之一,具有存在時(shí)間短、攻擊性強(qiáng)、破壞性大等特點(diǎn),生物體內(nèi)多余的·OH會(huì)對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生非常嚴(yán)重的影響。

根據(jù)經(jīng)典的水楊酸法,測(cè)定了Fenton反應(yīng)中配合物清除·OH的能力,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。從圖中可以看出,金雀異黃酮、山奈酚和配合物1和2清除·OH的能力均隨著濃度的增大而增強(qiáng),并且在相同濃度下,山奈酚比金雀異黃酮清除·OH的能力強(qiáng),主要是因?yàn)樯侥畏訐碛懈嗟娜〈u基,能提供更多的羥基質(zhì)子。

圖6 黃酮配體和配合物對(duì)·OH清除率的影響Fig.6 The scavenging rates of the ligands and complexes to hydroxyl radicals

相對(duì)于黃酮配體,配合物清除·OH的能力都進(jìn)一步增強(qiáng),表明黃酮化合物與銅(II)之間存在的正協(xié)同作用。推測(cè)主要有以下原因:首先,當(dāng)銅(II)與配體的C4位羰基氧和C3或者C5位羥基氧雙齒配位形成超共軛結(jié)構(gòu)后,整個(gè)黃酮母核的共軛體系增大,電子的離域程度增加,使得配合物更容易提供電子,便于與·OH結(jié)合終止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。其次,黃酮配體與銅(II)形成配合物以后,母環(huán)中的C—C、C—H鍵的鍵長(zhǎng)會(huì)增加,整個(gè)分子的穩(wěn)定性降低,抗氧化活性會(huì)增加[17]。另外,配合物中的中心銅(II)所帶正電荷的離域作用會(huì)影響配體中羥基質(zhì)子的正電荷,并且中心銅(II)由于帶有較大的正電荷,呈現(xiàn)出較強(qiáng)的成鍵能力,在一定程度上增強(qiáng)了配合物的抗氧化活性。配合物1清除·OH的IC50(158 μmol/L)小于配合物2的IC50(129 μmol/L)(圖7),這一順序與金雀異黃酮、山奈酚清除·OH的活性大小順序一致,說(shuō)明在清除·OH的過(guò)程中,黃酮配體起主要作用。

圖7 配合物清除·OH的IC50值Fig.7 IC50 values of the complexes to hydroxyl radicals

3 結(jié)論

本文在無(wú)水乙醇-水混合溶劑中,分別以金雀異黃酮和山奈酚為配體,合成了2個(gè)銅(II)配合物:[Cu(Gen)2(H2O)2]·3H2O(1)、[Cu(Kae)2(H2O)2]·1.5H2O(2)并且進(jìn)行了表征。在配合物中,金雀異黃酮和山奈酚均以二齒配位的方式與中心銅離子配位,摩爾比為2∶1。