樟芝In-situ萃取發(fā)酵高產(chǎn)Antrodin C和Antroquinonol

劉曉鳳，張堯，王召初，杜超，鄒靈潔，劉豪棟，禹朝蔚，艾連中，夏永軍

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海，200093)

樟芝(Antrodiacamphorata)又稱牛樟芝、牛樟菇、紅樟菇等，屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、多孔菌科、臺(tái)芝屬。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，樟芝含有泛醌類物質(zhì)(ubiquinones)、多糖(polysaccharides)、三萜類物質(zhì)(triterpenoids)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)、腺苷(adenosine)、馬來酸與琥珀酸衍生物(maleic acid and succinic acid derivatives)等70多種生理活性物質(zhì)[1-5]，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保肝及抑制血小板凝集等多種生物活性作用[6-10]。樟芝人工培養(yǎng)主要分為深層液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵，而子實(shí)體栽培由于培養(yǎng)周期太長，培養(yǎng)難度較大而難以推廣。通過對(duì)樟芝不同人工培養(yǎng)方式的活性成分分析可知，樟芝固態(tài)發(fā)酵的活性成分種類和含量遠(yuǎn)高于液態(tài)發(fā)酵，樟芝固態(tài)發(fā)酵主要活性產(chǎn)物除了Antrodins類化合物之外，還有抗癌活性很好的泛醌類化合物[3,11-16]，但固態(tài)發(fā)酵存在難以大規(guī)模培養(yǎng)的缺點(diǎn)。常規(guī)液態(tài)發(fā)酵可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量菌絲體以及Antrodins類化合物，但是其他活性產(chǎn)物的種類偏少，活性產(chǎn)物的量偏低，無法發(fā)揮出液態(tài)發(fā)酵大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)。有許多學(xué)者對(duì)樟芝活性產(chǎn)物進(jìn)行合成調(diào)控實(shí)驗(yàn)[17-18]，主要是在發(fā)酵液中添加一些樟樹的提取物或相近樹種的提取物，考察對(duì)多糖以及三萜類化合物的誘導(dǎo)效果，而對(duì)樟芝菌絲體特有活性產(chǎn)物馬來酸琥珀酸的衍生物和泛醌類化合物相關(guān)研究較少。

原位分離技術(shù)基于在發(fā)酵過程中，通過從培養(yǎng)介質(zhì)中及時(shí)移走產(chǎn)物，達(dá)到減少產(chǎn)物抑制，從而提高原料的利用率和產(chǎn)品產(chǎn)率。對(duì)于連續(xù)發(fā)酵過程的實(shí)現(xiàn)具有重要意義。原位分離技術(shù)主要分為：溶劑萃取發(fā)酵法(油酸、叔胺等為萃取劑)、吸附法(離子交換樹脂、活性炭、高分子樹脂等)、膜法發(fā)酵(滲析、電滲析、中空纖維超濾膜、反滲透膜等)[19-20]。因此，本文擬建立樟芝高效的In-situ萃取發(fā)酵體系，用于提高樟芝液態(tài)發(fā)酵活性產(chǎn)物的產(chǎn)量和種類。

1 材料與方法

1.1 菌種

菌種樟芝S-29(A.camphorataS-29)為實(shí)驗(yàn)室分離獲得，并保藏于中國普通微生物細(xì)菌保藏管理中心，編號(hào)為CGMCC 9590。樟芝S-29接種于PDA斜面，于4 ℃保藏。

1.2 培養(yǎng)基以及培養(yǎng)方法

孢子懸浮液制備：取茄子瓶斜面，用含有Tween 80 (0.1%，V/V)的無菌水25 mL洗下茄子瓶斜面的孢子，鏡檢孢子數(shù)達(dá)到1×108個(gè)/mL。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，黃豆?jié){40 mL/L，檸檬酸0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，pH 5.0，搖瓶裝液量為100 mL/500 mL三角瓶，接種量為10%，150 r/min，28 ℃，培養(yǎng)4 d。

樟芝S-29發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)：發(fā)酵罐裝液量為4 L/7 L，接入種子液400 mL(10%)，攪拌速率為150 r/min，通氣量為1.5 vvm，發(fā)酵過程中發(fā)酵體積維持在4.4 L。

1.3 植物油添加時(shí)間的確定

在搖瓶In-situ萃取發(fā)酵條件下，發(fā)酵第4天添加質(zhì)量濃度為0.2 g/L的輔酶Q0，在第3、4、5、6天分別添加體積分?jǐn)?shù)為20%的植物油,第10 天結(jié)束發(fā)酵，確定富集Ac和Aq效果最佳的原位萃取劑的添加時(shí)間，并計(jì)算出Ac和Aq的釋放率。釋放率按公式(1)計(jì)算：

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1.4 輔酶Q0添加量的確定

在搖瓶In-situ萃取發(fā)酵條件下，發(fā)酵第3天添加體積分?jǐn)?shù)為20%的植物油，第4天分別添加質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L的輔酶Q0,第10天結(jié)束發(fā)酵，確定富集Ac和Aq效果最佳的輔酶Q0添加量。

1.5 樟芝S-29 7L發(fā)酵罐In-situ萃取發(fā)酵

在7 L發(fā)酵罐In-situ萃取發(fā)酵條件下，對(duì)照組：在發(fā)酵第4天，添加質(zhì)量濃度0.3 g/L輔酶Q0；實(shí)驗(yàn)組：在發(fā)酵第3天添加20%植物油，發(fā)酵第4天，添加質(zhì)量濃度0.3 g/L輔酶Q0。

1.6 植物油作為In-situ萃取劑的重復(fù)利用

樟芝In-situ萃取發(fā)酵結(jié)束后，靜置，回收上層植物油；回收的植物油中加入9倍體積的95%乙醇萃?。惠腿〉玫降挠拖嘤? 000 r/min,4 ℃離心10 min，將油相中的乙醇全部去除。經(jīng)以上處理得到的油相在樟芝In-situ萃取發(fā)酵中被重復(fù)利用多次。

1.7 分析方法

1.7.1 生物量的測(cè)定

生物量的測(cè)定采用菌體干重法。將發(fā)酵液抽濾，并用去離子水洗滌3遍菌體，收集菌體，60 ℃烘干至恒重后稱重。生物量按公式(1)計(jì)算：

教材的結(jié)構(gòu)性是指教材內(nèi)容展開要有層次，要符合學(xué)科知識(shí)的內(nèi)在邏輯，知識(shí)點(diǎn)之間要密切聯(lián)系．譬如，布魯納曾言，教學(xué)不是教知識(shí)，而是教知識(shí)的結(jié)構(gòu)[12]，美國數(shù)學(xué)委員會(huì)在其《呼喚變革：關(guān)于數(shù)學(xué)教師的數(shù)學(xué)修養(yǎng)的建議書》中特別提議未來所有的數(shù)學(xué)老師都要了解數(shù)學(xué)的來龍去脈的知識(shí)，并獲得對(duì)數(shù)學(xué)中許多重要概念的更深入的理解[13]．教材的結(jié)構(gòu)體系不僅影響學(xué)生學(xué)到了什么知識(shí)，還對(duì)學(xué)生是否能夠構(gòu)建具有數(shù)學(xué)文化內(nèi)涵的知識(shí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，這樣的結(jié)構(gòu)靠學(xué)習(xí)碎片化的知識(shí)是不可能完成的，必須建立在學(xué)習(xí)者對(duì)相關(guān)知識(shí)及其境脈的深刻理解的基礎(chǔ)上，因此，編寫教材時(shí)必須對(duì)知識(shí)的結(jié)構(gòu)體系慎重把握[14]．一般而

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式中：WDC為菌體干質(zhì)量，g；V為取樣體積，mL。

1.7.2 液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中乙醇萃取物的制備

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)樟芝S-29 10 d后，量取發(fā)酵液30 mL，抽濾，收集菌絲體，加入95%乙醇，研磨，并用95%乙醇定容至30 mL，50 ℃水浴振蕩萃取1 h，冷卻至室溫后，得到乙醇萃取物，再用0.22 μm濾膜微濾，4 ℃放置用于HPLC分析。

In-situ萃取發(fā)酵體系中，將發(fā)酵液靜置，取1 mL油相，加入9倍體積的95%乙醇，50 ℃水浴振蕩萃取1 h，冷卻至室溫后分液得到乙醇相，用0.22 μm濾膜微濾，4 ℃放置用于HPLC分析；菌絲體中活性成分制備方法同上。

1.7.3 樟芝S-29活性成分HPLC分析方法

HPLC分析條件如下：色譜柱為Sepax HP-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速1 mL/min，紫外檢測(cè)波長254 nm，進(jìn)樣量為20 μL。流動(dòng)相A為pH值3.0的三氟乙酸水，流動(dòng)相B為乙腈，采用梯度洗脫，洗脫梯度如下：0～4 min，流動(dòng)相B：35%～57%；4～10 min，流動(dòng)相B：57%～70%；10～15 min，流動(dòng)相B：70%～90%；15～18 min，流動(dòng)相B：90%～100%；18～28 min，流動(dòng)相B：35%～100%。根據(jù)Ac和Aq的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算其含量。In-situ萃取發(fā)酵體系中Ac或Aq總含量(mg/L)按公式(3)計(jì)算。

總含量/(mg·L-1)=菌體中的含量(mg/L)+

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1.8 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件IBM SPSS Statistics 24進(jìn)行方差分析，實(shí)驗(yàn)所測(cè)數(shù)據(jù)以x±s表示。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物油添加時(shí)間對(duì)樟芝S-29活性成分的影響

植物油添加時(shí)間對(duì)樟芝In-situ萃取發(fā)酵具有顯著影響。植物油的主要成分為直鏈高級(jí)脂肪酸及其甘油酯，黏度較大，對(duì)樟芝活性成分合成有一定影響。如圖1所示，添加質(zhì)量濃度為0.2 g/L的輔酶Q0，發(fā)酵第3天添加植物油，樟芝S-29活性成分Ac和Aq總產(chǎn)量達(dá)到最大，分別為206.77 mg/L、86.36 mg/L，較輔酶Q0誘導(dǎo)發(fā)酵組分別提高了170.7%和539.1%。隨著添加時(shí)間的延后，2種活性產(chǎn)物的產(chǎn)量逐漸下降；當(dāng)?shù)?天添加時(shí)，Ac和Aq總產(chǎn)量僅有120.23 mg/L、37.05 mg/L。然而，植物油添加時(shí)間對(duì)活性成分的釋放率沒有顯著影響，2種成分的釋放率均在80%以上。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[17]，萃取劑的添加時(shí)間會(huì)對(duì)樟芝的菌絲體產(chǎn)生一定影響，添加過早或過晚都不利于活性產(chǎn)物的合成。KEVIN等[21]發(fā)現(xiàn)，輔酶Q衍生物易受與輔酶Q合成相關(guān)的前體物質(zhì)(4-羥基苯甲酸和油酸)的誘導(dǎo)，油酸可以作為樟芝泛醌類組分的前體物，從而提高其活性成分含量，因此，在發(fā)酵早期添加植物油，其中的油酸能夠提高Aq的產(chǎn)量。

KB-常規(guī)液態(tài)發(fā)酵；FM-輔酶Q0誘導(dǎo)發(fā)酵圖1 植物油添加時(shí)間對(duì)樟芝S-29活性成分的影響Fig.1 Effect of adding time of vegetable oil on the active components of A. camphorataS-29

2.2 輔酶Q0添加量對(duì)樟芝S-29活性成分的影響

輔酶Q0的添加量對(duì)Aq的合成具有顯著的影響，它可作為樟芝泛醌類組分的前體物，通過聚酮體等途徑，促進(jìn)樟芝活性物質(zhì)Aq的合成[17]。如圖2所示，當(dāng)添加0.1～0.3 g/L輔酶Q0，隨著輔酶Q0添加量的進(jìn)一步增加，Aq的產(chǎn)量不斷增加，當(dāng)輔酶Q0的添加量為0.3 g/L時(shí)Aq產(chǎn)量最大，為111.31 mg/L。但樟芝S-29的菌體量隨著輔酶Q0添加量的增加而逐漸減小，說明輔酶Q0會(huì)抑制菌絲體的生長。因此高濃度的輔酶Q0不利于Aq合成，圖3為不同發(fā)酵體系下，樟芝發(fā)酵第10天菌絲球照片。由圖3可知，輔酶Q0的添加量對(duì)樟芝S-29菌絲球形態(tài)、顏色等具有顯著性影響。如圖3-a所示，在常規(guī)液態(tài)發(fā)酵體系中，樟芝S-29菌絲球圓潤、形狀規(guī)則，菌絲球顏色呈現(xiàn)均一的淡黃色。如圖3-b所示，輔酶Q0誘導(dǎo)發(fā)酵體系中，樟芝S-29菌絲球形狀不規(guī)則，體積明顯小于常規(guī)液態(tài)發(fā)酵組，主要表現(xiàn)為單個(gè)菌絲球的平均直徑減小，菌絲球顏色呈現(xiàn)非均一的黃褐色，表明輔酶Q0可以影響樟芝S-29菌體形態(tài)。如圖3-c所示，以植物油為萃取劑的In-situ萃取發(fā)酵體系中，樟芝S-29菌絲球體積恢復(fù)到常規(guī)液態(tài)發(fā)酵狀態(tài)，樟芝S-29菌絲球圓潤、形狀規(guī)則，菌絲球顏色呈現(xiàn)均一的乳白色，說明植物油作為原位萃取劑，對(duì)輔酶Q0的生長抑制作用起到了一定緩解作用。研究表明[22-25]，輔酶Q0對(duì)樟芝代謝合成Aq的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過程，菌體量與活性物質(zhì)的產(chǎn)量呈正相關(guān)性。植物油緩解了輔酶Q0生長抑制作用，菌絲體恢復(fù)正常生長狀態(tài)，增加了Aq的產(chǎn)量。但植物油對(duì)輔酶Q0生長抑制的緩解作用有一定限度，因此較高濃度的輔酶Q0對(duì)Aq的合成起到抑制作用。

圖2 輔酶Q0添加量對(duì)樟芝S-29 Aq的影響Fig.2 Effect of the concentration of CoQ0 on Aq ofA. camphorata S-29

a-常規(guī)液態(tài)發(fā)酵;b-輔酶Q0誘導(dǎo)發(fā)酵;c-In-situ萃取發(fā)酵圖3 不同體系中樟芝S-29菌絲體生長情況Fig.3 Growth of mycelium in different systems

2.3 植物油萃取發(fā)酵過程曲線分析

將搖瓶實(shí)驗(yàn)條件下建立的輔酶Q0誘導(dǎo)In-situ萃取發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，于7 L發(fā)酵罐上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。7 L發(fā)酵罐In-situ萃取發(fā)酵產(chǎn)Ac和Aq的過程曲線圖，如圖4所示。發(fā)酵前4 d菌體處于生長的對(duì)數(shù)期，菌體量迅速增加，耗氧增加，溶氧值(dissolved oxygen, DO)迅速降為16%，第4天添加輔酶Q0后，對(duì)照組(輔酶Q0組)和實(shí)驗(yàn)組(In-situ萃取發(fā)酵組)的DO都有一定回升。植物油在In-situ萃取發(fā)酵體系中可以作為良好的氧載體，因此實(shí)驗(yàn)組的DO值遠(yuǎn)高于對(duì)照組。樟芝為好氧菌，菌絲體的生長與氧含量呈正相關(guān)性，植物油的添加使整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)中氧含量大大增加，此外植物油緩解了輔酶Q0的生長抑制作用，菌絲體恢復(fù)正常生長狀態(tài)，因此實(shí)驗(yàn)組第5～10天菌絲體快速生長，菌體量大幅增加，而對(duì)照組從第6天開始，樟芝S-29處于30%左右的溶氧環(huán)境，菌絲體生長緩慢，菌體量增加速率遠(yuǎn)低于實(shí)驗(yàn)組。第 13 天以后由于樟芝S-29進(jìn)入衰亡期，使得菌體量大幅度降低。

A-DO和菌體量;B-Ac和Aq質(zhì)量濃度圖4 樟芝S-29 In-situ萃取發(fā)酵過程曲線Fig.4 In-situ removal fermentation’s process curve ofA. camphorata S-29

樟芝發(fā)酵產(chǎn)Ac和Aq是一個(gè)耗氧的過程，Ac和Aq的產(chǎn)量與DO值呈一定的相關(guān)性。如圖4所示，實(shí)驗(yàn)組隨著DO值增加，Ac和Aq的合成速率迅速增加。Ac在發(fā)酵第17 天達(dá)到最大值486.01 mg/L，比對(duì)照組提高272.1%，此外，植物油對(duì)Ac起到一定保護(hù)作用，與實(shí)驗(yàn)組相比，對(duì)照組發(fā)酵21 d Ac量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，大量Ac被降解。在第96小時(shí)添加0.3 g/L輔酶Q0和20%植物油對(duì)菌體合成Aq具有顯著效果，添加輔酶Q024 h后樣品中有3.69 mg/L Aq檢出，隨著菌體量大幅度增加，Aq的累積速度也隨之加快；當(dāng)菌體不再增加時(shí)，Aq仍保持較快的積累速度，發(fā)酵第14天Aq產(chǎn)量達(dá)到最高110.06 mg/L。與實(shí)驗(yàn)組相比，對(duì)照組在添加輔酶Q0后第2天菌體已經(jīng)處于穩(wěn)定期狀態(tài)，菌體量幾乎不再增加，在添加輔酶Q0后第4天，Aq的產(chǎn)量接近最大值37.5 mg/L，遠(yuǎn)低于In-situ萃取發(fā)酵體系A(chǔ)q的量。

2.4 植物油In-situ萃取發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析

在In-situ萃取發(fā)酵體系中，植物油以乳濁液的形式均勻地分散于水相中，使得氧穿過水邊界層的滲透力增強(qiáng)，從而有利于氧傳遞的進(jìn)行[26-28]，以此提高活性產(chǎn)物的濃度。圖5為不同發(fā)酵體系下，樟芝發(fā)酵第10天樣品的HPLC圖。如圖5-A所示，在常規(guī)液態(tài)發(fā)酵體系過程中，樟芝S-29菌絲體主要含有Antrodins類化合物，以Ac為主，但不能合成Aq等化合物。如圖5-B、5-C和5-E所示，在輔酶Q0誘導(dǎo)發(fā)酵基礎(chǔ)上，添加植物油進(jìn)行In-situ萃取發(fā)酵，能夠顯著提高樟芝S-29菌絲體活性成分種類和產(chǎn)量，除了誘導(dǎo)Aq大量合成之外，還增加了Ac的產(chǎn)量。由圖5-D可知，樟芝S-29產(chǎn)生的大多數(shù)活性物質(zhì)不溶于水，添加植物油進(jìn)行In-situ萃取發(fā)酵，樟芝S-29產(chǎn)生的活性物質(zhì)不斷被富集、萃取轉(zhuǎn)移到油相。

a-常規(guī)液態(tài)發(fā)酵菌體HPLC圖譜；b-輔酶Q0誘導(dǎo)單相體系發(fā)酵菌體HPLC圖譜；c-樟芝In-situ萃取發(fā)酵體系中菌體HPLC圖譜；d-樟芝In-situ萃取發(fā)酵體系中發(fā)酵液HPLC圖譜；e-樟芝In-situ萃取發(fā)酵體系中油相HPLC圖譜(稀釋10倍)；1-Ac;2-Aq圖5 樟芝S-29液態(tài)發(fā)酵代表性樣品的HPLC圖譜Fig.5 HPLC chromatogram of representative samples ofA. camphorata S-29 by submerged fermentation

在In-situ萃取發(fā)酵體系中，樟芝S-29活性產(chǎn)物不斷地被植物油從細(xì)胞內(nèi)萃取出來，從而減小胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的積累壓力，因此大幅度提高活性產(chǎn)物產(chǎn)量。此外，絲狀真菌在發(fā)酵過程中，菌絲體纏繞成小球或橢球狀，表現(xiàn)黏度大，好氧速率高，溶氧水平快速降低到微生物的臨界溶氧濃度下，對(duì)微生物的正常生長和發(fā)酵產(chǎn)生影響[29]。植物油作為良好的氧載體，可以增加氧氣的溶解度，強(qiáng)化氧傳遞，促進(jìn)菌體本身生長，從而促進(jìn)菌體合成活性代謝產(chǎn)物。

2.5 植物油作為In-situ萃取劑重復(fù)利用的研究

樟芝In-situ萃取發(fā)酵結(jié)束后回收的植物油，經(jīng)95%乙醇萃取，高速離心等處理后得到的油相，在樟芝In-situ萃取發(fā)酵中被重復(fù)利用多次，結(jié)果如圖6所示。新鮮植物油作為原位萃取劑，Ac和Aq的產(chǎn)量分別為209.2 mg/L和109.6 mg/L；重復(fù)利用4次的植物油作為原位萃取劑，Ac和Aq的產(chǎn)量分別為188.5 mg/L和91.8 mg/L，因此重復(fù)利用4次的植物油對(duì)目標(biāo)物Ac和Aq產(chǎn)物的富集能力與新鮮植物油相比沒有顯著性差異，說明植物油作為原位萃取劑可以被重復(fù)利用。經(jīng)簡單的回收工藝的植物油，在其有限次重復(fù)使用的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)重復(fù)利用的植物油在發(fā)酵過程中對(duì)Ac和Aq的萃取富集能力相對(duì)比較穩(wěn)定，并未因其重復(fù)使用次數(shù)的增加而顯著下降，這些結(jié)果也能表明植物油作為原位萃取劑，可以進(jìn)行重復(fù)利用。

圖6 植物油作為In-situ萃取劑重復(fù)利用Fig.6 Recycling of vegetable oil as In-situ extractant

3 結(jié)論

針對(duì)樟芝液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)Ac和Aq產(chǎn)量低的問題，且基于Ac和Aq難溶于發(fā)酵液，建立1種In-situ萃取的發(fā)酵體系。發(fā)酵優(yōu)化后最佳結(jié)果是于發(fā)酵第4天與第3天，分別添加 3% 輔酶Q0(V/V) 與 20% (V/V) 植物油，待發(fā)酵結(jié)束后，Ac總含量為486.01 mg/L較對(duì)照組提高272.1%。Aq產(chǎn)量為 110.06 mg/L較對(duì)照組提高了293.5%。大大緩解了樟芝液態(tài)發(fā)酵過程存在的Ac和Aq等產(chǎn)物抑制的不利影響，且該體系穩(wěn)定性良好。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),作為原位萃取劑使用的植物油，其回收工藝簡單，且回收率達(dá)到 90%以上，回收的植物油作為原位萃取劑重復(fù)使用，對(duì)Ac和Aq的萃取富集能力相對(duì)比較穩(wěn)定，能夠進(jìn)行有限次的重復(fù)使用。