塵肺患者早期血清特異性miRNA水平變化

馮媛

北京市化工職業(yè)病防治院呼吸科，北京 100093

塵肺是指生產(chǎn)性粉塵在肺組織內(nèi)潴留引起的肺組織彌漫性纖維化[1]。塵肺一旦發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)，且易引起肺結(jié)核、支氣管炎及肺癌等病變[2-3]。塵肺病變的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)漸進(jìn)過程，從開始接塵到發(fā)現(xiàn)臨床塵肺，一般要十?dāng)?shù)年或更長的時(shí)間。且該病并無特異臨床表現(xiàn)，主要有咳痰、呼吸困難等呼吸道癥狀，在早期塵肺中上述表現(xiàn)不明顯[4]。因此，尋找一種可用于塵肺患者早期診斷的特異性指標(biāo)極為必要。miRNA被證實(shí)與多種臟器的纖維化進(jìn)程緊密相關(guān)[5-6]。本次研究觀察塵肺患者血清miRNA表達(dá)水平變化情況，篩選塵肺早期篩查指標(biāo)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2014年7月至2018年3月收治的160例塵肺患者進(jìn)行研究，按病程分為I期組與II期組，均符合《GBZ 70-2009塵肺病診斷標(biāo)準(zhǔn)》中塵肺病診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。另抽取80例男性健康體檢者作為對(duì)照組，對(duì)照組入組者無粉塵接觸史、無重要臟器器質(zhì)性病變。所有研究對(duì)象入組前均簽署知情同意書，自愿參與研究。三組研究對(duì)象一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可比性良好，見表1。

1.2 研究方案

每人抽取5 mL外周靜脈血，提取血清并置于EP管中，零下80℃條件下保存，采用QiaGen miReasy Mini Kit試劑盒提取總RNA，總RNA提取成功后保存于零下80℃。隨機(jī)抽取6例塵肺患者及6例健康體檢者血清樣本，采用TaqMan Human MicroRNA Array Set v2.0低密度芯片對(duì)667個(gè)已知的miRNA進(jìn)行篩選，爾后采用實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對(duì)低密度芯片篩選出的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。操作均按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 觀察指標(biāo)

miRNA表達(dá)水平：采用實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)，以相對(duì)定量法評(píng)估m(xù)iRNA表達(dá)水平，選擇cel-miR-39作為外參，樣本ΔCt（達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)）=CtmiR—Ctcel-miR-39，ΔCt越低表明miRNA表達(dá)水平越高。結(jié)果分析采用SDS2.4與RQ Manager1.2 軟件。

miRNA標(biāo)志物篩選標(biāo)準(zhǔn)：I期組及II期組合并為塵肺組，ΔΔCt=塵肺組ΔCt—對(duì)照組ΔCt，ΔΔCt=絕對(duì)組≥2的miRNA納入篩查范圍，進(jìn)行驗(yàn)證。最終共納入10個(gè)miRNAs，如表2所示。

表2 miRNAs驗(yàn)證指標(biāo)（x±s）

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)本臨床研究的所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以（n/%）表示，并采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（x±s）表示，多組比較采用F檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析，P＜0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA水平變化情況比較

將10個(gè)ΔΔCt≥2的miRNAs納入驗(yàn)證，其水平變化情況如表3所示。方差分析提示miR-200c、miR-16、miR-21、miR-206、miR-204、miR-29a及miR-155表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組間比較發(fā)現(xiàn)I期組及II期組miR-21、miR-200c、miR-16、miR-206、miR-29a及miR-155表達(dá)水平均高于對(duì)照組，而miR-204表達(dá)水平低于對(duì)照組，其中I期組miR-21表達(dá)水平低于II期組，而miR-204表達(dá)水平高于II期組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 miRNAs水平變化情況比較（ΔCt，x±s）

2.2 miRNA水平與病程相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miR-21與病程進(jìn)展正相關(guān)(rs=0.682)，miR-204與病程進(jìn)展負(fù)相關(guān)(rs=-0.713)，相關(guān)關(guān)系均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。

3 討論

塵肺對(duì)個(gè)人和社會(huì)均可造成較大負(fù)擔(dān)和損失，人均年社會(huì)生產(chǎn)力損失高達(dá)60.85萬元[8-9]。因此，盡早明確診斷并早期進(jìn)行干預(yù)具有重要意義。目前在《GBZ 70-2009塵肺病診斷標(biāo)準(zhǔn)》中仍以胸部X線影像作為診斷塵肺病的主要手段。但胸部X線片需要肺組織發(fā)生纖維化后才能發(fā)現(xiàn)病變，且不同水平的醫(yī)師讀片結(jié)果差異較大[10-11]。CT、MRI等影像學(xué)手段在塵肺的診斷中也有一定應(yīng)用，但分別因費(fèi)用高、對(duì)肺纖維化敏感性低等原因限制了其應(yīng)用價(jià)值[12-13]。近年來較多研究對(duì)早期診斷生物標(biāo)志物進(jìn)行探索，集中在微量元素、血清蛋白、氧化劑與抗氧化劑、細(xì)胞因子與凋亡相關(guān)因子等方面，但都存在敏感性與特異性低的特點(diǎn)，尚未取得突破性進(jìn)展[14]。而BALF檢查與肺活檢具有侵入性，臨床應(yīng)用有較大限制。因此，尋找一種生物標(biāo)志物用于塵肺早期診斷具有重大的應(yīng)用價(jià)值及社會(huì)效益。

miRNA是一種內(nèi)源性非編碼小RNA，參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡等過程，在多種疾病的進(jìn)展中起著重要調(diào)節(jié)作用[15]。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA在血清中的形態(tài)非常穩(wěn)定，可避免被內(nèi)源性核酸核糖酶降解[16]。同時(shí)，miRNA在酸堿異常、溫度異常及反復(fù)凍融條件下均能保持溫度，具有作為生物學(xué)指標(biāo)的優(yōu)勢(shì)[17]。miRNA與肺組織纖維化緊密相關(guān)。有研究對(duì)慢性阻塞性肺疾病患者484個(gè)miRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中150個(gè)miRNA表達(dá)水平下調(diào)2-3倍[18]。還有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-155表達(dá)水平與小鼠肺組織纖維化程度正相關(guān)[19]。Sun等[20]的研究也發(fā)現(xiàn)小鼠肺纖維化模型中miR-21等多個(gè)miRNA表達(dá)異常。還有研究證實(shí)miR-149 的多態(tài)性與塵肺易感性相關(guān)[21]。肺組織纖維化是塵肺的主要病理基礎(chǔ)，miRNA可能與塵肺進(jìn)展有關(guān)[22]。

本次研究首先采用Taq低密度芯片對(duì)667個(gè)已知的miRNA進(jìn)行篩選，爾后采用實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對(duì)篩選出的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn) miR-200c、miR-16、miR-21、miR-206、miR-204、miR-29a及miR-155等7個(gè)miRNA表達(dá)水平表達(dá)異常。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)I期組及II期組miR-21、miR-200c、miR-16、miR-206、miR-29a及miR-155表達(dá)水平均高于對(duì)照組，而miR-204表達(dá)水平低于對(duì)照組，其中I期組miR-21表達(dá)水平低于II期組，而miR-204表達(dá)水平高于II期組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

劉理靜等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化患者miR-21表達(dá)水平增高，而降低其表達(dá)水平后肺纖維化嚴(yán)重程度隨之下降。miR-155主要通過促進(jìn)白介素-8分泌加重肺纖維化程度。腫瘤生長因子β1是促纖維化因子，其表達(dá)水平增高可抑制miR-29a的表達(dá)[24]。miR-200c的表達(dá)水平也與腫瘤生長因子β1有關(guān)，調(diào)節(jié)其表達(dá)水平可在一定程度上改善肺纖維化程度[25]。miR-206、miR-16與miR-204被證實(shí)可通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)聚集[26]。miRNA主要通過抑制或降解靶mRNA發(fā)揮作用，本次研究結(jié)果表明以上7個(gè)miRNA可能通過影響相應(yīng)的靶miRNA參與塵肺的發(fā)生發(fā)展。Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miR-21與病程進(jìn)展正相關(guān)(rs=0.682)，miR-204與病程進(jìn)展負(fù)相關(guān)(rs=-0.713)，表明這兩個(gè)miRNA可能作用于影響病情進(jìn)展的mRNA，進(jìn)而影響塵肺病情的進(jìn)展，但其具體作用機(jī)制有待下一步研究。

總 之，miR-200c、miR-16、miR-21、miR-206、miR-204、miR-29a及miR-155等miRNA在塵肺患者血清中表達(dá)水平異常，其中miR-21與miR-204在不同病程時(shí)表達(dá)水平差異較大，可為塵肺患者早期篩查提供新的思路。