黃連素對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素、瘦素、TNF-α和IL-6的影響

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2型糖尿病的主要發(fā)病機(jī)制是胰島素抵抗(IR)，但I(xiàn)R發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，目前仍未完全明確，炎癥介質(zhì)及脂肪因子可能參與IR的發(fā)生。黃連素是一種異喹啉類生物堿，從小檗屬植物黃連、黃柏根莖提取。已有研究證實(shí)，黃連素通過多種途徑改善IR，如參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕氧化應(yīng)激、參與調(diào)節(jié)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[1-2]。黃連素可增加能量代謝、葡萄糖耐量，改善高脂喂養(yǎng)小鼠的代謝功能[3]；能增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平，減輕肝臟IR[4]。黃連素通過激活腺苷酸(AMP)激酶信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，減輕脂肪組織纖維化，從而減輕肥胖相關(guān)IR[5]。黃連素對IR炎癥介質(zhì)和脂肪因子分泌的影響尚不明確。本研究觀察黃連素對IR 3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素、瘦素及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素6(IL-6)蛋白分泌的影響，進(jìn)一步探討黃連素改善脂肪細(xì)胞IR的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 3T3-L1前脂肪細(xì)胞株購自CTCC公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM高糖/無糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素購于Hyclone，1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤購于Sigma，地塞米松購于碧云天，胰島素購于諾和諾德，黃連素購于上海康九化工有限公司，IL-6及TNF-α酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒購于北京四正柏技術(shù)公司，葡萄糖檢測試劑盒購于北京福瑞生物技術(shù)公司，瘦素抗體及脂聯(lián)素抗體購于武漢博士德公司，β-actin抗體、BCA蛋白檢測試劑盒購于Santa Cruz，Marker購于AMRESCO，抗兔二抗購于碧云天，其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 全自動酶標(biāo)儀MK3、垂直電泳裝置、半干式轉(zhuǎn)印儀(美國Bio-Rad公司)，Image Tool 3.0全自動圖像分析系統(tǒng)(Olympus公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脂肪細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 37 ℃、5% CO2條件下，3T3-L1前脂肪細(xì)胞于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞狀態(tài)良好時接種于培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合后，加入含1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤0.5 mmol/L、地塞米松1 μmol/L、胰島素10 μg/mL、10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，更換含胰島素10 μg/mL培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h，之后以10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔48 h換培養(yǎng)液1次，誘導(dǎo)分化8～12 d，待90%以上呈脂肪細(xì)胞表型即可用于實(shí)驗(yàn)。經(jīng)1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤、地塞米松、胰島素誘導(dǎo)分化8～12 d后，細(xì)胞變圓、變亮，細(xì)胞質(zhì)中大量圓形脂肪滴聚集，且90%以上呈脂肪細(xì)胞表型，為成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞。

1.2.2 3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型建立 將細(xì)胞分組處理，更換含地塞米松10 μmol/L的DMEM無糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，誘導(dǎo)IR，取上清液，之后更換DMEM高糖培養(yǎng)基，并加入胰島素100 μg/mL繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取上清液。正常狀態(tài)下3T3-L1脂肪細(xì)胞經(jīng)胰島素刺激后，葡萄糖消耗量顯著增加，經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)后，加入胰島素，與對照組比較葡萄糖消耗量減少，說明細(xì)胞出現(xiàn)IR，提示造模成功。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為對照組、IR組和黃連素組。其中對照組正常培養(yǎng)，IR組和黃連素組按照1.2.2誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生IR，黃連素組同時加入黃連素20 μmol/L。

1.2.4 葡萄糖消耗量測定 分別測定地塞米松誘導(dǎo)前后和胰島素加入前后細(xì)胞上清液中葡萄糖含量。

1.2.5 免疫印跡試驗(yàn)檢測脂聯(lián)素、瘦素蛋白表達(dá)情況 使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后提取總蛋白，根據(jù)BCA試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)整上樣量。取蛋白50 μg進(jìn)行蛋白變性后，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離，轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2 h，4 ℃搖床一抗孵育過夜。磷酸緩沖鹽溶液洗滌后加入二抗，室溫下?lián)u床孵育2 h，充分洗滌，ECL顯色。定影后應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。通過圖像分析軟件讀取所測蛋白灰度值，將所得灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值比值作為相應(yīng)蛋白的相對表達(dá)量，進(jìn)行半定量分析。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法檢測TNF-α、IL-6濃度 收集各組細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1 3組葡萄糖消耗量比較(見表1)

與對照組比較，1)P<0.05；與IR組比較，2)P<0.05

2.2 脂聯(lián)素和瘦素蛋白表達(dá)量測定 結(jié)果顯示：細(xì)胞形成IR后，脂聯(lián)素分泌減少，瘦素分泌增加；加入黃連素后，脂聯(lián)素分泌增加，瘦素分泌減少，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1、表2。

圖1 3組脂聯(lián)素和瘦素蛋白表達(dá)

表2 3組脂聯(lián)素、瘦素蛋白灰度值比較(±s)

與對照組比較，1)P<0.05；與IR組比較，2)P<0.05

2.3 3組TNF-α和IL-6水平比較 細(xì)胞形成IR后，TNF-α、IL-6蛋白分泌明顯增加；加入黃連素后，TNF-α、IL-6蛋白分泌減少，仍顯著高于對照組(P<0.05)。詳見表3。

表3 3組TNF-α和IL-6水平比較(±s) ng/L

與對照組比較，1)P<0.05；與IR組比較，2)P<0.05

3 討 論

目前研究表明，脂肪組織是一個重要的內(nèi)分泌器官，可分泌多種生物活性物質(zhì)，包括瘦素、脂聯(lián)素、TNF-α、IL-6等多種脂肪因子和炎癥因子，這些因子通過自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌途徑參與各種復(fù)雜代謝過程，形成復(fù)雜的脂肪細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，在糖脂代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

脂聯(lián)素是脂肪組織分泌的一種分子量為28 kD的凝膠結(jié)合蛋白，具有改善IR、促進(jìn)葡萄糖攝取、抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥等作用。有研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素水平與IR程度呈負(fù)相關(guān)，脂聯(lián)素水平升高可增加胰島素敏感性，IR減輕，反之，脂聯(lián)素水平降低則IR加重[6-7]。瘦素作為一種代謝激素，除影響脂肪的分解、合成外，還可影響胰島素釋放及葡萄糖代謝[8]。有研究表明，血清瘦素作為一種糖尿病病人的早期生化標(biāo)志物，與IR密切相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，IR組脂聯(lián)素水平降低，瘦素水平升高，表明脂聯(lián)素與瘦素參與IR的發(fā)生。進(jìn)一步研究結(jié)果證實(shí)，給予黃連素干預(yù)后，脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素水平升高，瘦素水平降低，提示黃連素通過影響脂聯(lián)素和瘦素水平進(jìn)而改善IR。

既往研究顯示，在IR發(fā)生過程中，有免疫細(xì)胞、炎性介質(zhì)參與，其中較重要的因子有TNF-α、IL-6[10]。本研究結(jié)果顯示，IR組TNF-α、IL-6水平較對照組升高，提示TNF-α、IL-6參與IR過程。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可抑制胰島素受體與底物結(jié)合，增加外周游離脂肪酸濃度，引起脂質(zhì)代謝紊亂，降低葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4含量，進(jìn)一步降低脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖能力[11-12]；TNF-α可促進(jìn)炎癥細(xì)胞分泌多種炎癥因子，包括IL-6，抑制脂聯(lián)素產(chǎn)生[13]。IL-6作為重要的炎癥因子，具有加重IR作用。糖尿病病人IL-6水平升高[14-15]；肥胖病人常同時存在IR，機(jī)體內(nèi)存在低水平慢性炎癥，IL-6水平升高[16]。IL-6可抑制胰島素受體底物磷酸化、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)及蛋白激酶B(AKT)激活，進(jìn)而影響下游一系列的級聯(lián)反應(yīng)，抑制胰島素信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，降低胰島素敏感性，參與IR的發(fā)生[17-18]；同時IL-6能促進(jìn)脂肪分解，增加外周游離脂肪酸，誘發(fā)脂代謝紊亂，間接誘導(dǎo)IR[19]。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用黃連素干預(yù)后，TNF-α、IL-6分泌減少，表明黃連素可能促進(jìn)IR狀態(tài)下脂肪細(xì)胞TNF-α、IL-6分泌減少，從而發(fā)揮改善IR作用。

綜上所述，黃連素可能通過增加脂聯(lián)素蛋白表達(dá)，降低瘦素和TNF-α、IL-6蛋白水平，從而改善高胰島素血癥。對IR的臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義，但仍需對其作用的分子機(jī)制進(jìn)行深入探討。