奇異變形桿菌毒力因子的研究進(jìn)展

陳小敏， 楊 華， 桂國(guó)弘， 溫雪婷， 戴寶玲 ， 肖英平*

(1.浙江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021；3.浙江省植物有害生物防控省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州 310021)

奇異變形桿菌(Proteusmirabilis，PM)是革蘭陰性細(xì)菌，屬于腸桿菌科，群集運(yùn)動(dòng)是奇異變形桿菌的特殊運(yùn)動(dòng)形式，該菌最初由Hauser在1885年發(fā)現(xiàn)，并以希臘神明的名字為其命名，意為可以任意變化形狀來(lái)避免被質(zhì)疑[1]。奇異變形桿菌在自然界中廣泛存在，可在土壤、污水中檢測(cè)到，也可寄生在人和動(dòng)物的腸道，與臨床關(guān)系密切，常出現(xiàn)在人類和動(dòng)物的機(jī)會(huì)性感染中。尿路感染(UTI)是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，在全球范圍內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。2007年，僅在美國(guó)，UTI有1 050萬(wàn)次問(wèn)診量(占所有門診訪問(wèn)的0.9%)，2萬(wàn)～3萬(wàn)急診部門訪問(wèn)，這種感染的社會(huì)成本，包括醫(yī)療費(fèi)用和工作時(shí)間，每年約為35億美元[2]。奇異變形桿菌是引起UTI的原因之一，通常與尿路梗阻、導(dǎo)尿管阻塞、膀胱和腎結(jié)石形成以及菌尿有關(guān)，并且奇異變形桿菌是引起復(fù)雜尿路感染(CAUTI)的主要原因，最終導(dǎo)致敗血癥或全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，是死亡率在20%～50%的嚴(yán)重疾病[3]。奇異變形桿菌致病機(jī)理復(fù)雜，通過(guò)導(dǎo)尿管到達(dá)膀胱后可在0.5 h 后黏附并侵入膀胱上皮細(xì)胞，24 h后在聚集部位引起毒素釋放、局部氨(NH3)的濃度增加、大量嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，組合效應(yīng)導(dǎo)致結(jié)晶礦物沉積和尿路上皮表面的破壞[4]，其主要毒力因子包括菌毛、尿素酶、溶血素、金屬攝取和免疫逃避等。

1 菌 毛

引起CAUTE的第一步是進(jìn)入尿道，盡管導(dǎo)管提供了直接通向膀胱的路徑，但是奇異變形桿菌需要緊緊地黏附在導(dǎo)管上以抵抗尿液的流動(dòng)，并橫穿流動(dòng)的尿液或破壞尿液的流動(dòng)進(jìn)入膀胱。奇異變形桿菌易定殖在導(dǎo)管的內(nèi)腔和外表面，與菌毛對(duì)尿路上皮的附著以及形成生物膜有關(guān)。

全基因組測(cè)序結(jié)果顯示奇異變形桿菌有17種可能的菌毛，其中，耐甘露糖樣變形桿菌菌毛(MRP)、尿路上皮細(xì)胞黏附菌毛(UCA)、室溫菌毛(ATF)、奇異變形桿菌菌毛(PMF)對(duì)UTI作用的研究較為廣泛。Paola等[5]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MPR、UCA、ATF、PMF均有助于形成穩(wěn)定的生物膜。首先，其菌毛突變體在導(dǎo)尿管中的遷移能力都顯著降低，其次，與野生型相比，MRP和ATF菌毛突變體形成較小的生物膜，UCA和PMF菌毛突變體形成了較大的生物膜，顯示出菌毛各自不同的生物結(jié)構(gòu)特征。UCA菌毛突變體與野生型菌株相比，對(duì)脫落的尿路皮細(xì)胞的黏附力明顯降低，該結(jié)果支持UCA可能在與泌尿系統(tǒng)上尿道粘連中起重要作用，并可能在腎臟定殖中發(fā)揮作用[6]。

MRP被認(rèn)為是研究奇異變形桿菌菌毛的最佳對(duì)象，是參與黏附、遺傳毒性和細(xì)胞毒性的重要毒力因子[7]。分別在奇異變形桿菌感染后的1、3、7 d收集尿液，提取尿液中的細(xì)菌RNA進(jìn)行基因芯片和qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，編碼MRP的基因是上調(diào)倍數(shù)最高的基因，其中MRP的主要結(jié)構(gòu)基因mrpA上調(diào)了13 800倍[8]。耐甘露糖樣變形桿菌菌毛(MRP)操縱子由MrpI、含可逆元件(IE)的基因間區(qū)域和mrpABCDEFGHJ基因簇組成，MRP操縱子中的最后一個(gè)基因mrpJ可能在奇異變形桿菌的毒力中起著全局調(diào)控的作用。報(bào)道顯示mrpJ在臨床分離物中普遍保守[9]，小鼠尿道感染模型中mrpJ缺失突變體在膀胱中定殖水平明顯降低，基因芯片分析發(fā)現(xiàn)UTI期間mrpJ的模擬控制表達(dá)引起217個(gè)與細(xì)菌毒力、VI型分泌系統(tǒng)和新陳代謝基因的表達(dá)差異[10]，mrpJ調(diào)控幾種已知和預(yù)測(cè)的毒力因子的證據(jù)，包括其自身的MRP操縱子、群集細(xì)胞分化因子、Pta毒素、ZapA蛋白酶和VI型分泌系統(tǒng)(T6SS)[11]。

2 脲 酶

奇異變形桿菌很少形成膀胱細(xì)胞內(nèi)群落，它在膀胱腔中建立了大規(guī)模的脲酶和MRP菌毛依賴的細(xì)胞外集群，引起強(qiáng)烈的嗜中性粒細(xì)胞反應(yīng)，與尿路上皮破壞等相關(guān)。通過(guò)比較奇異變形桿菌野生型和突變體的定殖，確定了脲酶和MRP為群集發(fā)育所需的兩個(gè)重要毒力因子[12]。與單一細(xì)菌感染的小鼠相比發(fā)現(xiàn)，兩種細(xì)菌共感染的小鼠表現(xiàn)出更高的尿液pH值、尿石癥、菌血癥以及更顯著的組織損傷和炎癥，而脲酶活性的增強(qiáng)是促使組織損傷和共感染期間兩種細(xì)菌向血流傳播的主要因素[13]。

圖1 奇異變形桿菌HI4320中ure基因簇及蛋白產(chǎn)物Fig.1 Ure genes clusters and its protein products in Proteus mirabilis HI4320

脲酶是Ni2+依賴性金屬酶，在植物、真菌和細(xì)菌中均存在，根據(jù)來(lái)源不同，脲酶的結(jié)構(gòu)組成有所不同，細(xì)菌中的脲酶(除了幽門螺桿菌脲酶)通常由3個(gè)不同的亞基組成，連接在一起形成三聚體，激活其脲酶載脂蛋白并組裝其金屬中心，至少需要3種輔助蛋白質(zhì)：UreD、UreF和UreG[14]。奇異變形桿菌的脲酶基因簇由ureRDABCEFG組成，結(jié)構(gòu)亞基γ、β和α分別由ureA、ureB和ureC編碼[15]。脲酶對(duì)奇異變形桿菌的致病性十分重要，其催化尿素水解成二氧化碳和氨，導(dǎo)致局部pH升高，隨后形成磷酸銨鎂(鳥(niǎo)糞石)和鈣磷酸鹽(磷灰石)沉淀，此過(guò)程的結(jié)果以導(dǎo)管中生物膜的形成和腎結(jié)石的積累為特征，引起輸尿管阻塞、對(duì)宿主細(xì)胞的氨毒性和直接的組織損傷。這種晶體聚集產(chǎn)生結(jié)石使感染復(fù)雜化有三個(gè)原因：首先，結(jié)石間隙內(nèi)的奇異變形桿菌難以用抗生素清除；第二，結(jié)石作為非奇異變形桿菌細(xì)菌的病灶發(fā)生UTI；第三，結(jié)石可以阻止尿流，尿液排泄不暢和回流到腎臟可能導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，包括腎盂腎炎、敗血病、休克等。

3 金屬攝取

在UTI期間，宿主和細(xì)菌爭(zhēng)奪對(duì)基本金屬的獲取，細(xì)菌贏得競(jìng)爭(zhēng)將有利于UTI的建立。研究表明細(xì)菌攝取Fe3+、Zn2+和Ni2+，并輸出Cu+，對(duì)于在泌尿系統(tǒng)的成功定殖至關(guān)重要[16]。

鐵作為一種重要元素，對(duì)于不同生物過(guò)程的許多蛋白質(zhì)和酶的功能而言是必需的。細(xì)菌必須使用專門的系統(tǒng)從宿主中獲取鐵，最初，人們認(rèn)為奇異變形桿菌缺乏鐵載體的能力，奇異變形桿菌HI4320的基因組注釋和鐵限制條件下的基因芯片分析推測(cè)奇異變形桿菌中至少有21個(gè)鐵攝取系統(tǒng)，其中的2個(gè)已被證明具有與鐵載體生物合成和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因[8，17]。其中一種是先前未在任何細(xì)菌中被描述過(guò)的非核糖體肽合成酶(NRPS)-非依賴性鐵載體(NIS)系統(tǒng)，現(xiàn)被稱為變形桿菌素(由操縱子pbtABCDEFGHI編碼)[17]。另一種含nrp操縱子，已顯示nrp操縱子在奇異變形桿菌 HI4320 的高致病島(HPI)內(nèi)編碼，其與耶爾森氏菌的HPI具有同源性[18]。

鋅是另一種對(duì)許多蛋白質(zhì)和酶的功能至關(guān)重要的金屬，奇異變形桿菌具有鋅限制條件下生長(zhǎng)所需的功能性鋅攝取系統(tǒng)(ZnuABC)，Greta[19]等的研究首次表明，在實(shí)驗(yàn)性尿路感染的小鼠模型中，攝取鋅的能力有助于感染期間奇異變形桿菌的適應(yīng)，為其提供了競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。ZnuC在奇異變形桿菌的鋅攝取中發(fā)揮作用，其存在使得奇異變形桿菌在鋅限制條件下生長(zhǎng)至更高的密度，并在基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)；鋅的吸收有助于奇異變形桿菌的運(yùn)動(dòng)，ZnuC基因拷貝中斷的菌株運(yùn)動(dòng)能力顯著降低并產(chǎn)生更少的鞭毛蛋白。

鎳是多種酶(包括脲酶)的重要輔助因子，Ni2+對(duì)于脲酶的催化是不可或缺的。然而，編碼鎳ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PMI2943-PMI2947)的基因都不是奇異變形桿菌的重要適應(yīng)因子。清除和攝取金屬的能力是許多病原體的關(guān)鍵特征，但金屬外排轉(zhuǎn)換也是避免自身毒性的重要方面[16]，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)高濃度的過(guò)渡金屬是有毒的，它們會(huì)干擾細(xì)胞的氧化還原電位并產(chǎn)生高反應(yīng)性的羥基自由基。通過(guò)在基本培養(yǎng)基中加入硫酸鎳干擾奇異變形桿菌生長(zhǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，PMI1518(推測(cè)編碼高親和力的鎳輸出蛋白)突變菌株對(duì)鎳更敏感，具體表現(xiàn)為在培養(yǎng)基中添加0.625 mmol/L硫酸鎳時(shí)生長(zhǎng)速度顯著變慢，在5 mmol/L硫酸鎳條件下生長(zhǎng)被完全抑制，證明PMI1518編碼有助于鎳耐受性的鎳外排體，PMI1518編碼的高親和力鎳輸出蛋白是腎定殖的重要適應(yīng)因子[20]。

在細(xì)菌中，銅被用作催化一些參與電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的金屬酶，如細(xì)胞色素氧化酶，同時(shí)，也是銅解毒酶的輔因子[21-22]。銅中毒對(duì)細(xì)菌細(xì)胞有毒害作用，因此，細(xì)胞內(nèi)銅的水平必須得到很好的控制。奇異變形桿菌ScsC (PmScsC)是一種獨(dú)特而高度動(dòng)態(tài)的二硫鍵異構(gòu)酶，N-末端殘基將3個(gè)催化結(jié)構(gòu)域一起帶入三聚體中，并且獨(dú)特的柔性連接體使得能夠進(jìn)行非凡的扭轉(zhuǎn)和延伸運(yùn)動(dòng)來(lái)影響催化結(jié)構(gòu)域，研究表明，PmScsC三聚作用及其活性位點(diǎn)半胱氨酸，是銅的存在下野生型奇異變形桿菌群集活性所必需的，這種蜂擁現(xiàn)象有助于銅中毒的防御[23]。

4 細(xì)菌毒素

溶血素(HpmA)和變形桿菌毒性凝集素(Pta)對(duì)于組織破壞和細(xì)菌傳播至腎臟是重要的[24]。HpmA是一種具有溶血活性的胞外蛋白，通過(guò)將其自身插入細(xì)胞膜使宿主細(xì)胞不穩(wěn)定引起穿孔，導(dǎo)致組織損傷、剝脫和營(yíng)養(yǎng)物釋放。Pta是一種具有絲氨酸蛋白酶活性的自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可刺穿宿主細(xì)胞膜，引起細(xì)胞溶質(zhì)外流、滲透壓改變和絲狀體解聚，損害細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性，導(dǎo)致膀胱和腎臟損傷。

毒素作為毒力因子的角色并沒(méi)有被完全解釋清楚。在單一因子的CAUTI(復(fù)雜尿路感染)中，溶血素未被認(rèn)為是重要的適應(yīng)因子，可能是因?yàn)镃AUTI感染模型中導(dǎo)管引起的炎癥和組織損傷水平較高，不需要大量毒素的貢獻(xiàn)。通過(guò)對(duì)奇異變形桿菌毒力基因產(chǎn)物的調(diào)查，人們認(rèn)為HpmA可能是NLRP3炎性小體活化和產(chǎn)生IL-1 β的必需條件[25]。研究一系列羧基末端賴氨酸突變體發(fā)現(xiàn)，HpmA溶血活性的喪失與羧基末端氨基酸Leu263被替代相關(guān)[26]。

5 免疫逃避

宿主與病原體之間進(jìn)行著持續(xù)不斷的斗爭(zhēng)，宿主內(nèi)寄生的細(xì)菌必須逃避體內(nèi)的先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答才能獲得生存機(jī)會(huì)，在與各自宿主進(jìn)行共同進(jìn)化的過(guò)程中，微生物已經(jīng)制定了一些規(guī)避宿主固有和適應(yīng)性免疫因子的策略。

奇異變形桿菌有多種免疫逃避機(jī)制。第一，這種微生物可表達(dá)多種菌毛和鞭毛，從而欺騙免疫系統(tǒng)。細(xì)菌鞭毛是一種非常復(fù)雜的分子機(jī)器，在發(fā)病中具有多種作用[27-28]，包括達(dá)到最佳宿主位置、定殖或入侵、在感染部位維持以及感染后擴(kuò)散。一旦到達(dá)目標(biāo)位置，鞭毛可協(xié)助黏附到表面，分化成生物膜、分泌效應(yīng)分子并進(jìn)一步穿透組織結(jié)構(gòu)或激活吞噬作用進(jìn)入真核細(xì)胞，在感染發(fā)生后，鞭毛通過(guò)改變基因表達(dá)或進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾來(lái)躲避宿主的免疫防御。鞭毛蛋白是鞭毛的結(jié)構(gòu)組分，奇異變形桿菌鞭毛蛋白具有在T24膀胱細(xì)胞和經(jīng)鞭毛蛋白尿道滴注后的小鼠膀胱中誘導(dǎo)促炎因子表達(dá)的能力，此外，鞭毛蛋白引發(fā)炎癥，促使白細(xì)胞募集到膀胱上皮細(xì)胞[29]。第二，奇異變形桿菌編碼金屬蛋白酶(ZaPA)，裂解血清中的免疫球蛋白IgA1、IgA2和IgG，為躲避黏膜免疫提供保護(hù)。第三，生物膜的形成可防止細(xì)菌被洗刷出去，相比浮游菌能耐受更高劑量的抗生素[30]，為奇異變形桿菌提供了一個(gè)躲避免疫系統(tǒng)追蹤和抗菌治療的避難所，被認(rèn)為是持續(xù)感染和炎癥的最終原因[31]。

6 其他因素

除了上述常見(jiàn)毒力因子外，人們也發(fā)現(xiàn)了一些與致病性相關(guān)的其他因素。多磷酸激酶(PPK)由ppk基因編碼，Liang等[32]研究表明PPK是重要的調(diào)節(jié)因子，ppk突變菌株缺乏對(duì)尿路上皮細(xì)胞的黏附和侵襲能力，并影響奇異變形桿菌的群集運(yùn)動(dòng)能力和生物膜形成能力，在致病性奇異變形桿菌的毒力中扮演重要角色。Hfq是一種RNA分子伴侶，影響許多與奇異變形桿菌毒力相關(guān)的表型，包括運(yùn)動(dòng)性、生物膜形成和對(duì)壓力如高滲透壓的抗性[33]。環(huán)AMP受體蛋白(Crp)是細(xì)菌中的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，Tsai等[34]的研究證明，Crp影響奇異變形桿菌的包括運(yùn)動(dòng)性、菌毛介導(dǎo)的黏附性、對(duì)葡萄糖的耐逆性等毒力相關(guān)的表型。

7 展 望

認(rèn)識(shí)和理解引起感染的細(xì)菌的毒力因子，可為這些臨床問(wèn)題的診斷和治療的解決方案提供基礎(chǔ)，闡明奇異變形桿菌感染過(guò)程以及與宿主間的相互作用，是理解和預(yù)防奇異變形桿菌感染的關(guān)鍵。雖然現(xiàn)有的研究已經(jīng)確認(rèn)奇異變形桿菌可以引起尿路感染并產(chǎn)生尿路結(jié)石，新型研究方法的使用也為深層次了解奇異變形桿菌的分子特征提供了幫助，但關(guān)于奇異變形桿菌究竟如何引起疾病發(fā)生仍有疑問(wèn)。為了進(jìn)一步探索其致病機(jī)制，可能還需要進(jìn)一步分析導(dǎo)尿管、膀胱和腎臟感染之間的有機(jī)聯(lián)系，確定各毒力因子在感染各階段的生活方式。