奶牛源乳酸菌的分離、鑒定及其微生態(tài)制劑的研究

桑夢(mèng)琪， 喻 琴,2， 邵 丹， 董書(shū)偉， 王東升， 張世棟， 武小虎*， 嚴(yán)作廷*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

奶牛子宮內(nèi)膜炎是危害奶牛生產(chǎn)的主要繁殖疾病。引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的因素較多，其中病原微生物的感染是主要因素之一，引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的病原菌主要有大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、化膿隱秘桿菌以及少量的沙門氏菌。近年來(lái)的研究表明引起奶牛子宮內(nèi)膜炎主要原因是棲居在生殖系統(tǒng)內(nèi)的菌群平衡被打破，導(dǎo)致乳酸菌等益生菌菌株減少，而其他病原微生物大量繁殖，從而引發(fā)子宮內(nèi)膜炎。發(fā)生子宮內(nèi)膜炎的奶牛性周期發(fā)生紊亂，發(fā)情周期紊亂，并由于子宮等炎癥的影響，精子活力降低，影響受精卵及胚胎著床，最終導(dǎo)致奶牛不孕，繁殖率降低，產(chǎn)奶量下降[1-3]，成為嚴(yán)重危害奶牛業(yè)發(fā)展的四大疾病之一[4-5]。近年來(lái)微生態(tài)制劑以綠色、健康、無(wú)污染等特點(diǎn)逐漸引起人們的關(guān)注。目前關(guān)于益生性的乳酸菌分離已有少量報(bào)道，分離到多種諸如乳酸桿菌、乳酸球菌、糞腸球菌等可以抑制病原微生物的益生菌株[6-8]，這些菌株成為研究微生態(tài)制劑的最好材料。田豐松等[9]從健康奶牛的陰道樣本中分離鑒定出乳酸菌，得到有較好的抑菌能力和產(chǎn)酸性能的菌株，抑菌試驗(yàn)顯示能抑制大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌菌株的生長(zhǎng)。朱芬花等[10]研究發(fā)現(xiàn)從健康奶牛陰道內(nèi)篩選分離并鑒定出的乳酸菌，菌株均具有較好的產(chǎn)酸能力，試驗(yàn)顯示產(chǎn)酸能力越強(qiáng)抑菌能力越強(qiáng)。李向楠[11]從健康奶牛生殖道中分離并鑒定出4株具有益生功能的乳酸菌，產(chǎn)酸性能較好，有一定的產(chǎn)H2O2能力。單一菌株和復(fù)合菌株對(duì)大腸埃希菌的抑菌效果是不同的，菌株存在不相容性。從抑菌試驗(yàn)來(lái)看，可能增強(qiáng)也可能減弱。趙靜等[12]采用同樣方法，也獲得了從宿主分離純化出的益生菌復(fù)合效果較強(qiáng)于單一的益生菌。這些研究的參考意義在于可以考慮多種益生乳酸菌制成復(fù)合的微生態(tài)制劑來(lái)進(jìn)行更好的防治，同時(shí)考慮乳酸菌之間的相容性，避免出現(xiàn)益生菌之間的拮抗影響制劑效果，最大化益生菌的安全性[13]。本研究以產(chǎn)后30～50 d健康奶牛的子宮頸口處分泌物為菌源，通過(guò)分離鑒定和抑菌、生長(zhǎng)及產(chǎn)酸能力試驗(yàn)，以期篩選防治奶牛子宮內(nèi)膜炎能力強(qiáng)的益生乳酸菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌源樣品 乳酸菌菌源子宮黏液樣品均采集自甘肅省荷斯坦奶牛繁育示范中心和燎原乳業(yè)集團(tuán)豐源養(yǎng)殖基地，產(chǎn)后30～50 d的健康荷斯坦奶牛；大腸埃希菌為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室分離和保存。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯、營(yíng)養(yǎng)肉湯、伊紅美蘭培養(yǎng)基、TE緩沖液、10%SDS、1%的瓊脂糖凝膠、酚/氯仿/異戊醇、異丙醇和M0401通用細(xì)菌采樣管；16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(TaKaRa)、DNA提取試劑盒(Omega)；細(xì)菌生化鑒定管(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

1.1.3 儀器與設(shè)備 LAI-3-T厭氧培養(yǎng)箱、Alphaclean 1300垂直流潔凈工作臺(tái)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱、電冰箱、DHG-9035A電熱鼓風(fēng)干燥箱、LDZX-30KB立式壓力蒸汽滅菌器、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、Thermoscientificnanodrop2000超微量核酸測(cè)定儀、WP-UPL超純水機(jī)、SEDI-G PCR擴(kuò)增儀、游標(biāo)卡尺、電泳儀、Azure biosystems凝膠成像系統(tǒng)、梅特勒-托利多便攜式pH計(jì)Five go F2等。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與增菌培養(yǎng)試驗(yàn) 選擇健康的產(chǎn)后奶牛，采集子宮頸口處黏液2～8 mL迅速注入配制好的MRS液體培養(yǎng)基的試管中，置于冰盒中4 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，接種MRS乳酸菌選擇性平板，置于厭氧培養(yǎng)箱中，于0.5%～1.5%低氧氣濃度下，37 ℃增菌培養(yǎng)。

1.2.2 分離和純化 經(jīng)過(guò)18～24 h初步增菌后，于厭氧操作臺(tái)中，用一次性接種棒挑取具有乳酸球菌或乳酸桿菌典型菌落形態(tài)的菌落分別劃線接種于MRS平板，將平板倒置在厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。如此反復(fù)挑劃單菌落，連續(xù)傳代接種2～4次，直至平板上出現(xiàn)菌落形態(tài)、大小、顏色一致，且通過(guò)染色鏡檢時(shí)菌落形態(tài)單一，無(wú)雜菌。挑取已純培養(yǎng)的菌落接種MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，鏡檢確定菌落形態(tài)單一，染色特性一致，即可將菌株進(jìn)行凍存，或者暫存于4 ℃，以便用于下一步試驗(yàn)[14]。

1.2.3 革蘭染色和鏡檢 參考《獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[15]對(duì)各分離菌株進(jìn)行革蘭染色和鏡檢。

1.2.4 觸酶試驗(yàn) 將1滴3%的H2O2滴于干凈的載玻片上，用接種環(huán)挑取1環(huán)培養(yǎng)18 h的單菌落浸泡在新配制好的H2O2溶液中并進(jìn)行涂抹，若有氣泡出現(xiàn)則為陽(yáng)性，無(wú)氣泡為陰性。

1.2.5 生化鑒定 用乳酸菌細(xì)菌生化鑒定管對(duì)分離菌株進(jìn)行生化鑒定：挑取疑似乳酸菌新鮮純培養(yǎng)菌落，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至6×108cfu/mL，各取0.05～0.08 mL的菌懸濁液加入到每種微量西林瓶中，套上膠塞，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后觀察結(jié)果。

1.2.6 乳酸菌DNA的提取 按照Omega DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌基因組DNA，獲得的DNA經(jīng)超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，于-20 ℃保存。

1.2.7 乳酸菌16S rDNA擴(kuò)增 采用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit試劑盒，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：模板1 μL，PCR Premix 12.5 μL(包含TaKaRa ExTaq、反應(yīng)用Buffer、dNTP Mixture等)，上游引物和下游引物各0.25 μL，16S-free H2O 11 μL。陰性對(duì)照使用1 μL的16S-free H2O替代模板DNA，陽(yáng)性對(duì)照取1 μL的Positive Control DNA 作為模板。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性1 min;58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保溫。預(yù)先制備好1.0%的瓊脂糖凝膠，擴(kuò)增反應(yīng)完畢后，取6 μL PCR產(chǎn)物與2 μL上樣緩沖液混合，電壓120 V電泳30 min后，Azure Biosystems 凝膠成像儀下觀察和掃描圖像。

1.2.8 16S rDNA序列測(cè)定及分析 將獲得的PCR產(chǎn)物送北京華大科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將得到16S rDNA全序列采用DNAstar 7.1軟件組件Seqman對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，刪除上下游引物對(duì)應(yīng)序列后保存。使用NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列Blast進(jìn)行比對(duì)，以確定各分離菌株的物種歸屬。

1.2.9 單株細(xì)菌上清抑菌試驗(yàn) ①乳酸菌上清的制備：參考劉冬梅等[16]、李向楠[11]報(bào)道并進(jìn)行改進(jìn)，采用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)各分離菌株對(duì)大腸埃希菌抑菌能力。將乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h后，8 000 r/min離心20 min，取上清用0.22 μm細(xì)菌濾器過(guò)濾除菌，立即使用或凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。②抑菌試?yàn)：將牛津杯放在制備好的MH藥敏試驗(yàn)平板上，平板上均勻涂布0.2 mL的108cfu/mL致病菌菌液，吸取0.2 mL乳酸菌上清，加入上述MH平板的牛津杯內(nèi)，將平板于37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)立3個(gè)重復(fù)。具有抑菌能力的乳酸菌上清會(huì)在牛津杯周圍形成一個(gè)透明的抑菌圈，抑菌圈的直徑越大，則對(duì)應(yīng)菌株對(duì)致病菌的抑制能力越強(qiáng)；不具備抑菌活性的乳酸菌上清，在牛津杯周圍沒(méi)有抑菌圈，細(xì)菌均勻生長(zhǎng)。

1.2.10 混合上清抑菌試驗(yàn) 將得到的乳酸菌厭氧培養(yǎng)18 h收集上清，按照0.2 mL的總量將上清分別進(jìn)行等量混合，放置備用。具體方法同1.2.9，混合上清加入牛津杯放到均勻涂布有指示菌的平板上，37 ℃需氧培養(yǎng)18～24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)直徑，并進(jìn)行記錄和分析。

1.2.11 生長(zhǎng)曲線 每株菌株對(duì)應(yīng)13支試管，試管的編號(hào)標(biāo)明培養(yǎng)時(shí)間：0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24 h。用移液器吸取1麥?zhǔn)蠁挝坏娜樗峋? mL接入盛有100 mL培養(yǎng)基(MRS)的三角瓶中，混合均勻后分別吸取2 mL菌液放入上述標(biāo)記好的13支試管中(每2 mL的復(fù)合液對(duì)應(yīng)0.2 mL的1麥?zhǔn)蠁挝蝗樗峋?。將已接種的試管用紗布包好后放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱內(nèi)，37 ℃靜置培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h后以標(biāo)記的時(shí)間依次將試管取出，用未接種的MRS液體培養(yǎng)基做空白對(duì)照，測(cè)量其OD600光密度值，紫外分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比濁測(cè)定。培養(yǎng)液測(cè)定前用渦旋振蕩器搖勻，依次測(cè)定OD600值。記錄試驗(yàn)結(jié)果，用MS Excel繪制表格。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。最佳生長(zhǎng)溫度的測(cè)定試驗(yàn)方法同上，查閱《伯杰式細(xì)菌系統(tǒng)學(xué)手冊(cè)》，乳酸菌最佳生長(zhǎng)條件約35～40 ℃。因此設(shè)置35、37、39、41 ℃四個(gè)梯度。單個(gè)菌株制備13支培養(yǎng)基試管并標(biāo)記好時(shí)間和菌號(hào)，培養(yǎng)18～24 h后，測(cè)量、記錄并用Excel繪制菌液生長(zhǎng)曲線。

1.2.12 產(chǎn)酸能力曲線 按照1.2.11得到每株菌株的最佳培養(yǎng)溫度，在最佳溫度培養(yǎng)下進(jìn)行產(chǎn)酸能力的測(cè)定。試驗(yàn)方法同上，單個(gè)菌株選取13支培養(yǎng)基試管并標(biāo)記好時(shí)間和菌號(hào)(1.2.11得到每株菌的最佳培養(yǎng)時(shí)間：生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)間)，培養(yǎng)后用pH計(jì)分別測(cè)量各個(gè)試管的pH值(室溫),以時(shí)間為橫坐標(biāo)，pH值為縱坐標(biāo)，Excel繪制細(xì)菌產(chǎn)酸能力曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離乳酸菌菌株革蘭染色鏡檢

由圖1可知，分離菌株均為革蘭陽(yáng)性細(xì)菌。其中，6、7號(hào)菌株鏡檢為陽(yáng)性桿菌，寬0.5～0.8 μm，長(zhǎng)約2～9 μm，單個(gè)或者成鏈出現(xiàn)。3、11、13、23號(hào)菌株鏡檢為陽(yáng)性球菌，直徑0.5～1.2 μm。與《伯杰式細(xì)菌系統(tǒng)學(xué)手冊(cè)》中乳酸桿菌、乳酸球菌的描述一致?？沙醪脚卸槿樗峋?。

2.2 菌株生化鑒定

分離菌株生化鑒定詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。觸媒試驗(yàn)均為陰性。根據(jù)細(xì)菌生化鑒定管說(shuō)明書(shū)對(duì)分離菌株生化鑒定結(jié)果進(jìn)行判定。將這些菌株接種七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊酸、山梨醇、蔗糖、棉子糖。結(jié)合生化鑒定結(jié)果，6號(hào)菌株七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、山梨醇、蔗糖、棉子糖發(fā)酵結(jié)果為陽(yáng)性，甘露醇、水楊酸發(fā)酵結(jié)果為陰性，疑似為德式乳桿菌；7號(hào)菌株七葉苷、纖維二糖、山梨醇、蔗糖、棉子糖發(fā)酵結(jié)果為陽(yáng)性，麥芽糖、甘露醇、水楊酸發(fā)酵結(jié)果為陰性，疑似為干酪乳桿菌；其他菌株生化鑒定未確定是哪種乳酸菌，需進(jìn)一步鑒定以明確其種屬歸類。

表1 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

注：“+”為陽(yáng)性，檢測(cè)菌株能夠發(fā)酵或利用七葉苷、纖維二糖、麥芽糖等上述8種物質(zhì)；“-”為陰性，檢測(cè)菌株不能發(fā)酵或利用上述物質(zhì)

2.3 16S rDNA基因擴(kuò)增

如圖2所示，標(biāo)識(shí)3～15為需要測(cè)序的乳酸菌株凝膠電泳結(jié)果，約1 500 bp。所得乳酸菌16S rDNA條帶單一、清楚，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可用于后續(xù)測(cè)序分析。

圖2 分離菌株16S rDNA凝膠電泳圖Fig.2 PCR amplification of 16S rDNAM1：2 000 bp DNA Marker；M2：1 000 bp DNA Marker；1：陰性對(duì)照16S-free H2O2；2：陽(yáng)性對(duì)照 1 100 bp；3：24號(hào)菌株；4：23號(hào)菌株；5：22號(hào)菌株；6：21號(hào)菌株；7：15號(hào)菌株；8：14號(hào)菌株；9：13號(hào)菌株；10：12號(hào)菌株；11：11號(hào)菌株；12：10號(hào)菌株；13：7號(hào)菌株；14：6號(hào)菌株；15：3號(hào)菌株M1：2 000 bp DNA marker; M2：1 000 bp DNA marker; 1：negative control 16S-free H2O2; 2：positive control 1 100 bp; 3：strain 24; 4：strain 23; 5：strain 22; 6：strain 21; 7：strain 15; 8：strain 14; 9：strain 13; 10：strain 12; 11：strain 11; 12：strain 10; 13：strain 7； 14：strain 6; 15：strain 3

2.4 測(cè)序比對(duì)

結(jié)合之前得到的生化鑒定結(jié)果，將分離菌株與NCBI 上分離菌株16S rDNA序列在線比對(duì)結(jié)果，確定7號(hào)菌株為乳酸桿菌，其與鼠李糖乳桿菌Lactobacillusmucosae(登錄號(hào)：NR_024994.1)的同源性為98%；6號(hào)菌株與胃乳酸桿菌Lactobacillusgastricus(登錄號(hào)：NR_029084.1)同源性達(dá)到98%；3號(hào)和23號(hào)菌株與乳球菌Lactococcuslaudensis(登錄號(hào)：NR_136466.1)同源性均為98%；但3號(hào)和23號(hào)菌株的生化鑒定結(jié)果不一致，推測(cè)可能是不同的種；10號(hào)菌株與海氏腸球菌Enterococcushirae(登錄號(hào)：LC 119115.1)同源性達(dá)到99%；11號(hào)菌株與魏斯氏細(xì)菌Weissellacibaria(登錄號(hào)：KU302758.1)同源性達(dá)到99%；13號(hào)菌株與糞腸球菌Enterococcusfaecalis(登錄號(hào)：MF369837.1)同源性達(dá)到99%。

2.5 單株細(xì)菌抑菌試驗(yàn)

經(jīng)37 ℃、18～24 h恒溫孵育，共篩選出對(duì)大腸埃希菌具有較強(qiáng)抑菌能力的菌株5株，依次為3號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、11號(hào)、13號(hào)、23號(hào)菌株。各分離菌株提取上清對(duì)致病性大腸埃希菌的抑制情況詳見(jiàn)表2。

表2 分離乳酸菌上清抑制致病性大腸埃希菌結(jié)果

2.6 混合菌株抑菌試驗(yàn)

采用混合上清對(duì)大腸埃希菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，7號(hào)、11號(hào)和13號(hào)的上清具有協(xié)同作用，也就是鼠李糖乳桿菌、魏斯式細(xì)菌和糞腸球菌混合上清的抑菌效果最好；3號(hào)、6號(hào)和11號(hào)也具有協(xié)同作用，其抑菌效果好于單菌和兩兩混合的效果；其他試驗(yàn)結(jié)果顯示混合的沒(méi)有單一或者兩兩混合的好，具體表現(xiàn)在混合的3號(hào)和6號(hào)、混合的3號(hào)和23號(hào)、混合的6號(hào)和11號(hào)、混合的7號(hào)和11號(hào)均沒(méi)有單一上清的抑菌效果好?；旌先樗峋陮?duì)大腸埃希菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，表中未寫出的組合表示未測(cè)到試驗(yàn)結(jié)果(如6+7)。

表3 混合乳酸菌上清抑制致病性大腸埃希菌結(jié)果

2.7 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

分別測(cè)量7號(hào)鼠李糖乳桿菌、11號(hào)魏斯式細(xì)菌和13號(hào)糞腸球菌在各個(gè)溫度下的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)7號(hào)鼠李糖乳桿菌OD600最高值為1.561 2，39 ℃時(shí)為其最佳生長(zhǎng)曲線，39 ℃下，到對(duì)數(shù)期的時(shí)間約16 h，見(jiàn)圖3A；11號(hào)魏斯式細(xì)菌的OD600最高值為1.561 2，39 ℃時(shí)為其最佳生長(zhǎng)曲線，39 ℃下，到對(duì)數(shù)期的時(shí)間約18 h，且41 ℃下出現(xiàn)了OD值偏小，生長(zhǎng)緩慢，因此試驗(yàn)得到的魏斯式細(xì)菌培養(yǎng)溫度不能超過(guò)41 ℃，見(jiàn)圖3B；13號(hào)糞腸球菌的OD600最高值為0.801 4，37 ℃時(shí)為其最佳生長(zhǎng)曲線，37 ℃下，到對(duì)數(shù)期的時(shí)間約16 h，見(jiàn)圖3C。

圖3 菌株生長(zhǎng)曲線Fig.3 Strain Growth curvesA：不同溫度下鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)曲線；B：不同溫度下魏斯式細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線；C：不同溫度下糞腸球菌的生長(zhǎng)曲線A： the growth curve of Lactobacillus mucosae at different temperatures; B： the growth curve of Weissella cibaria at different temperatures; C： the growth curve of Enterococcus faecalis at different temperatures

2.8 產(chǎn)酸能力試驗(yàn)

根據(jù)得到的3株菌株的最佳生長(zhǎng)溫度，得到每株菌株的產(chǎn)酸能力曲線(圖4)。培養(yǎng)基初始pH為5.85，培養(yǎng)液MRS液體培養(yǎng)基均為2 mL，在同樣的厭氧環(huán)境及最佳生長(zhǎng)溫度下進(jìn)行培養(yǎng)后，糞腸球菌產(chǎn)酸曲線斜率最大，0～8 h斜率最大產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，8 h后產(chǎn)酸能力直線下降，18 h趨于穩(wěn)定達(dá)到pH約4.2(圖4C)；魏斯式細(xì)菌產(chǎn)酸曲線分三段，0～6 h曲線斜率大，產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，6～16 h產(chǎn)酸能力降低，18～24 h幾乎不產(chǎn)酸(圖4B)；鼠李糖乳桿菌產(chǎn)酸能力分兩段，0～14 h產(chǎn)酸能力穩(wěn)定呈線性，14 h后產(chǎn)酸能力逐漸消失(圖4A)。

圖4 菌株產(chǎn)酸能力Fig.4 Acid production capacity of strainsA：最適溫度39 ℃下鼠李糖乳桿菌的產(chǎn)酸能力曲線；B：最適溫度下39 ℃魏斯式細(xì)菌的產(chǎn)酸能力曲線；C：最適溫度下37 ℃糞腸球菌的產(chǎn)酸能力曲線A：the acid production ability curve of Lactobacillus mucosae at the optimum temperature of 39 ℃; B：the acid production ability curve of Weissella cibaria at the optimum temperature of 39 ℃; C：the acid production ability curve of Enterococcus faecalis at the optimum temperature of 37 ℃

3 討 論

我國(guó)有源遠(yuǎn)流長(zhǎng)的乳酸菌利用的歷史，在食品以及飼料添加劑中都有乳酸菌的應(yīng)用[17]。本研究從產(chǎn)后健康奶牛的子宮頸口采集樣品，通過(guò)分離、培養(yǎng)、染色鏡檢、生化鑒定得到乳酸菌，這些乳酸菌作為益生菌應(yīng)用于微生態(tài)制劑中，來(lái)源于奶牛機(jī)體，又利用在奶牛機(jī)體上，更有利于其在奶牛生殖道內(nèi)的定殖及作用。本研究分離純化得到具有抑制大腸埃希菌的益生性乳酸菌共6株，經(jīng)過(guò)提取16S rDNA全序列測(cè)序和序列比對(duì)，確定得到的菌株為乳酸菌，而這些菌株中鼠李糖乳桿菌、糞腸球菌、魏斯式細(xì)菌都已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道和研究[14，18]，從奶牛中得到的乳酸菌取于機(jī)體又利用于機(jī)體，能更好更安全地應(yīng)用在微生態(tài)制劑的制作中。

乳酸菌是動(dòng)物體內(nèi)的常駐細(xì)菌，能定殖在機(jī)體形成屏障，使其他病原微生物無(wú)法定殖[19-20]；此外還能分泌多種生物活性物質(zhì)如甲酸、乙酸、乳酸、過(guò)氧化氫，以及細(xì)菌素等，這些產(chǎn)物能夠酸化微環(huán)境，抑制生殖道微環(huán)境中其他微生物的生長(zhǎng)和繁殖，從而起到維持陰道和子宮頸微生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定和宮頸健康的效果。本研究參考田豐松等[9]和李向楠[11]報(bào)道的有關(guān)益生菌特性研究的方法，進(jìn)行了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化。根據(jù)乳酸菌的基本生物學(xué)特性，以MRS培養(yǎng)基結(jié)合厭氧培養(yǎng)作為乳酸菌培養(yǎng)條件，通過(guò)高速離心和0.22 μm細(xì)菌濾膜過(guò)濾的方法，更快地得到了優(yōu)質(zhì)無(wú)菌的細(xì)菌培養(yǎng)物上清。從抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，乳酸菌培養(yǎng)上清對(duì)大腸埃希菌具有一定抑制作用，這與薛洋洋[14]、Parolin等[21]試驗(yàn)得到的結(jié)論相符。同時(shí)，本研究中乳酸菌株對(duì)致病菌的抑菌圈大小與文獻(xiàn)報(bào)道[22-24]的結(jié)果不盡相同，這可能與試驗(yàn)方法，試驗(yàn)所使用的乳酸菌來(lái)源、生存環(huán)境和測(cè)試致病菌株本身的特性有關(guān)。而混合抑菌試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，并不是將益生菌混合就會(huì)增強(qiáng)對(duì)致病菌的抑制效果，相反有些混合的比例還會(huì)導(dǎo)致抑菌圈變小，抑菌能力削弱，即不同細(xì)菌可能存在不相容性，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11，25]，因此對(duì)于混合菌株制作微生態(tài)制劑一定要謹(jǐn)慎試驗(yàn)和選擇。

這些試驗(yàn)表明了乳酸菌制劑為細(xì)菌性奶牛子宮內(nèi)膜炎的防治研究提供了一種新的方法。

結(jié)合《伯杰式細(xì)菌系統(tǒng)學(xué)手冊(cè)》，從4個(gè)不同溫度下以O(shè)D600值生長(zhǎng)曲線來(lái)看，魏斯式細(xì)菌最適溫度為39 ℃，最適溫度下生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期需要18 h，在39 ℃厭氧培養(yǎng)下培養(yǎng)液pH從5.85降到4.55，而pH趨于穩(wěn)定只需要16 h，從益生菌培養(yǎng)角度來(lái)說(shuō)得到的魏斯式細(xì)菌的培養(yǎng)條件可以優(yōu)化為39 ℃下16 h；鼠李糖乳桿菌最適溫度為39 ℃，在39 ℃下生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期需要16 h，pH趨于穩(wěn)定只需要14 h，鼠李糖乳桿菌的主要抑菌成分不是酸，從益生菌培養(yǎng)角度來(lái)說(shuō)鼠李糖乳桿菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化為39 ℃下16 h，此時(shí)培養(yǎng)液pH從5.85降到4.21；糞腸球菌最適溫度為37 ℃，在37 ℃下生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期需要18 h，pH趨于穩(wěn)定只需要12 h，培養(yǎng)液pH從5.85降到4.53，糞腸球菌的主要抑菌成分是有機(jī)酸類，從益生菌培養(yǎng)角度來(lái)說(shuō)糞腸球菌的培養(yǎng)條件可優(yōu)化為37 ℃下12 h。

本研究中分離獲得的鼠李糖乳桿菌、魏斯式細(xì)菌和糞腸球菌作為益生菌種,在動(dòng)物微生態(tài)制劑中的應(yīng)用效果如何, 還需要進(jìn)一步做動(dòng)物安全性試驗(yàn)和飼養(yǎng)試驗(yàn)才能確定。

本研究從健康奶牛子宮頸口黏液中分離純化出益生性乳酸菌，經(jīng)上清抑菌試驗(yàn)最終篩選出6株具有良好的抑制致病性大腸埃希菌的活性乳酸菌株，分別是鼠李糖乳桿菌、胃乳酸桿菌、海氏腸球菌、魏斯式細(xì)菌、糞腸球菌，菌株上清混合試驗(yàn)得到最佳的抑菌效果配伍組成并得到了這些細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸能力，為今后進(jìn)一步開(kāi)發(fā)用于防控奶牛子宮內(nèi)膜炎的微生態(tài)制劑提供了實(shí)驗(yàn)材料。