蒽酮硫酸比色法測(cè)甜菊素含量

周墨哲

摘 要：本實(shí)驗(yàn)確定了用蒽酮硫酸比色法測(cè)量甜菊素含量的方法，該方法的實(shí)驗(yàn)原理為甜菊素在酸性條件下水解為葡萄糖，葡萄糖與蒽酮試劑反應(yīng)，生成藍(lán)綠色物質(zhì)，在620nm處有吸收。吸收度與甜菊素的濃度有一定的線性關(guān)系。此方法和中國藥典方法對(duì)比分析時(shí)間更短，操作更簡(jiǎn)便。同時(shí)，本文對(duì)該方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，證明其精密度、準(zhǔn)確度、線性、耐用性等均符合定量測(cè)定的要求。

關(guān)鍵詞：甜菊素;硫酸蒽酮顯色法;含量測(cè)定

中圖分類號(hào)：R927 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2019）02-0207-02

甜菊素（又稱甜菊糖苷）為甜葉菊葉子的主要甜味物質(zhì)，從甜菊葉中提取出的甜菊素呈結(jié)晶狀，其甜度為砂糖的200倍。甜菊素是萊鮑迪甙A、萊鮑迪甙B、等的混合物。由于熱量低、易溶于水或酒精，也具耐熱性，是無熱量之代糖產(chǎn)品，是糖尿病患者的飲食或瘦身食品常用的甜味料。甜菊糖作為一種新型甜味劑，廣泛應(yīng)用于各類食品、飲料、醫(yī)藥、日化工業(yè)。所有國際監(jiān)管組織均將甜菊糖視為安全食用品。這些組織包括：食品規(guī)范委員會(huì)（CAC）、聯(lián)合國糧食農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織食物添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)（JECFA）、歐洲食品安全局（EFSA）、美國食品和藥物管理局（FDA）和新西蘭食品標(biāo)準(zhǔn)管理局（FSANZ）。

甜菊素在中國被收載入《中國藥典》2015版，在藥物制劑中作為甜味劑?！吨袊幍洹?015版用容量法測(cè)定甜菊素的含量，具體為：取本品約0.3g，精密稱定，置250ml錐形瓶中，加稀硫酸25ml與水25ml，振搖溶解后，加熱至微沸，水解30分鐘，冷卻，濾過，濾渣用水洗至中性后，加中性乙醇（對(duì)酚酞指示液顯中性）50ml，溶解后，再加酚酞指示液2滴，用乙醇制氫氧化鉀滴定液（0.05mol/L）滴定至溶液顯紅色，10秒鐘內(nèi)不褪。根據(jù)氫氧化鉀滴定液的消耗量計(jì)算甜菊素含量。

本實(shí)驗(yàn)用蒽酮硫酸比色法測(cè)甜菊素含量。具體原理為：甜菊素在酸性條件下水解為葡萄糖，葡萄糖與蒽酮試劑反應(yīng)，生成藍(lán)綠色物質(zhì)，在620nm處有吸收。吸收度與甜菊素的濃度有一定的線性關(guān)系。此方法和中國藥典方法對(duì)比分析時(shí)間更短，操作更簡(jiǎn)便。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：

1 蒽酮硫酸顯色條件確定

根據(jù)反應(yīng)原理，甜菊素在酸性條件下水解為葡萄糖，水解生成的葡萄糖與蒽酮在加熱和酸性條件下顯色，在620nm產(chǎn)生吸收。所以，本實(shí)驗(yàn)的甜菊素水解和顯色的條件至關(guān)重要。我們對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的確定做了如下實(shí)驗(yàn)：

供試樣品溶液為100ppm的甜菊素溶液。取一定量的蒽酮溶解于濃硫酸中，置于棕色試劑瓶，混合均勻后放于冰箱中保存（現(xiàn)配現(xiàn)用）?？疾炝蛩釢舛?、蒽酮含量、試劑用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度的影響，各因素下選取的選取的水平點(diǎn)分別為硫酸濃度：65%、75%、85%、98%;蒽酮質(zhì)量與硫酸體積比：0.1%、0.2%、0.3%、0.4%;樣品溶液與試劑的體積比：1：2、1：4、1：6、1：8;反應(yīng)溫度：40℃、60℃、80℃、100℃;反應(yīng)時(shí)間：7min、8min、9min、10min。其結(jié)果見表1。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到蒽酮硫酸顯色法最佳顯色條件為：

（1）蒽酮硫酸試劑的濃度為0.3%（即0.3g蒽酮溶解于100ml硫酸中）

（2）供試品甜菊素溶液的濃度為100ppm，用2ml甜菊素溶液與8ml蒽酮硫酸試劑反應(yīng)。

（3）將2ml甜菊素溶液與8ml蒽酮硫酸試劑在100℃的水浴中加熱7min，在620nm處檢測(cè)其吸光度。

我們確定的蒽酮硫酸比色法測(cè)甜菊素含量具體方法為：精密稱取甜菊素供試品0.1g，置于100ml容量瓶中，定容至刻度，精密吸取上述溶液10ml，置于100ml容量瓶中，定容至刻度，作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液2ml于10ml容量瓶中，用硫酸蒽酮試劑（0.3g蒽酮溶解于100ml 98%硫酸中）定容至刻度，混勻，在100℃的水浴中加熱7～10min，冷卻至室溫，在620nm處檢測(cè)其吸光度。另取甜菊素對(duì)照品，同法操作。按下列公式計(jì)算供試品甜菊素含量：

甜菊素含量=對(duì)照品稱樣量*供試品吸光度*對(duì)照品含量/供試品稱樣量*對(duì)照品吸光度

2 線性

按照確定的實(shí)驗(yàn)條件，分別用25、50、100、150、200ppm的甜菊素供試品溶液與顯色劑顯色后測(cè)吸光度，考察在含量測(cè)定濃度25～200%范圍內(nèi)的線性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2。

用蒽酮-硫酸法測(cè)定甜菊素在620nm處的吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，以吸光度（A）對(duì)甜菊素濃度（C）作回歸處理，求回歸方程為A=0.0046C -0.0023（R2=0.9998），甜菊素濃度在20～200ppm范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

3 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

為考察硫酸蒽酮顯色法測(cè)甜菊素含量的準(zhǔn)確度，我們用《中國藥典2015年版》甜菊素含量測(cè)定方法作為經(jīng)典方法，分別按各自確定的實(shí)驗(yàn)方法平行測(cè)定六次。用兩組含量測(cè)定結(jié)果的比值（回收率）來考察硫酸蒽酮顯色法的準(zhǔn)確度，結(jié)果見表3、表4。

由表可知，蒽酮硫酸顯色法測(cè)定的結(jié)果與參考方法測(cè)定的結(jié)果分別為97.4%和96.9%，回收率=97.4/96.9=100.5%。蒽酮硫酸顯色法測(cè)甜菊素含量準(zhǔn)確度符合要求。

4 精密度實(shí)驗(yàn)

為考察本方法的精密度（即重現(xiàn)性），我們分別在設(shè)計(jì)測(cè)試濃度的0.8倍、1倍、1.2倍進(jìn)行了考察。具體如下：

4.1 相當(dāng)于檢測(cè)濃度1倍的精密度實(shí)驗(yàn)

按確定的硫酸蒽酮顯色法測(cè)甜菊素含量，即精密稱取甜菊素供試品0.1g，置于100ml容量瓶中，定容至刻度，精密吸取上述溶液10ml，置于100ml容量瓶中，定容至刻度，作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液2ml于10ml容量瓶中，用硫酸蒽酮試劑（0.3g蒽酮溶解于100ml硫酸中）定容至刻度，混勻，在100℃的水浴中加熱7min，之后迅速放入冰浴中冷卻10min，在620nm處檢測(cè)其吸光度。

平行測(cè)定6次，結(jié)果如表5所示。

相當(dāng)于檢測(cè)濃度1.0倍的精密度實(shí)驗(yàn)RSD=0.34%，重現(xiàn)性好。

4.2 相當(dāng)于檢測(cè)濃度1.2倍的精密度實(shí)驗(yàn)

精密稱取甜菊素供試品0.12g，置于100ml容量瓶中，定容至刻度，精密吸取上述溶液10ml，置于100ml容量瓶中，定容至刻度，作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液2ml于10ml容量瓶中，用硫酸蒽酮試劑（0.3g蒽酮溶解于100ml硫酸中）定容至刻度，混勻，在100℃的水浴中加熱7min，之后迅速放入冰浴中冷卻10min，在620nm處檢測(cè)其吸光度。

平行測(cè)定6次，結(jié)果如表6所示。

相當(dāng)于檢測(cè)濃度1.2倍的精密度實(shí)驗(yàn)RSD=0.50%，重現(xiàn)性好。

4.3 相當(dāng)于檢測(cè)濃度0.8倍的精密度實(shí)驗(yàn)

按確定的硫酸蒽酮顯色法測(cè)甜菊素含量，即精密稱取甜菊素供試品0.08g，置于100ml容量瓶中，定容至刻度，精密吸取上述溶液10ml，置于100ml容量瓶中，定容至刻度，作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液2ml于10ml容量瓶中，用硫酸蒽酮試劑（0.3g蒽酮溶解于100ml硫酸中）定容至刻度，混勻，在100℃的水浴中加熱7min，之后迅速放入冰浴中冷卻10min，在620nm處檢測(cè)其吸光度。

平行測(cè)定6次，結(jié)果如表7所示。

相當(dāng)于檢測(cè)濃度0.8倍的精密度實(shí)驗(yàn)RSD=0.40%，重現(xiàn)性好。

小結(jié)：在設(shè)計(jì)濃度的0.8倍、1倍、1.2倍的精密度實(shí)驗(yàn)RSD分別為0.40%、0.34%、0.5%，本方法的重現(xiàn)性好。

5 耐用性實(shí)驗(yàn)

按確定的硫酸蒽酮顯色法測(cè)甜菊素含量的方法，將顯色后的甜菊素樣品溶液分別放置15min、30min、45min、60min、90min、120min，考察其穩(wěn)定性，結(jié)果如表8所示。

如表8所示，顯色后的樣品溶液在2小時(shí)內(nèi)的吸光度沒有明顯的變化，RSD=0.75%，也就是，顯色后的溶液的吸光度是穩(wěn)定的，該方法耐用性好。

6 結(jié)語

蒽酮硫酸試劑比色法用于測(cè)定甜菊素含量的準(zhǔn)確度、精密度、線性均符合定量分析的要求，是可行的。且該方法比藥典方法操作更省時(shí)，操作步驟少。

參考文獻(xiàn)

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