基于甲基化的年齡推斷模型構(gòu)建與效能評(píng)估

李?yuàn)欙w，彭付端，王建寧，仲建軍，趙慧，王玲，李永久，劉凡，李彩霞，豐蕾

（1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.公安部物證鑒定中心 現(xiàn)場(chǎng)物證溯源技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038；3.中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所，北京 100101；4.臨猗縣公安局，山西 臨猗 044100；5.德州市公安局，山東 德州 253012）

在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，個(gè)體年齡推斷一直是法醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。通過(guò)確定案件嫌疑人的年齡范圍，可以縮小調(diào)查范圍，為案件偵查提供重要的線(xiàn)索和證據(jù)[1-2]。當(dāng)前推斷個(gè)體年齡主要是通過(guò)檢測(cè)骨骼、牙齒等骨性指征，運(yùn)用法醫(yī)人類(lèi)學(xué)模型進(jìn)行年齡推斷[3-4]。在法醫(yī)學(xué)鑒定案件中，法醫(yī)人類(lèi)學(xué)方法由于骨骼檢材的缺失而受限。近年來(lái)的研究表明，生物分子標(biāo)志物可用于年齡推斷。已有研究人員針對(duì)線(xiàn)粒體DNA的損傷[5]、端?？s短[6]、T細(xì)胞重排[7]以及蛋白質(zhì)的改變，如天冬氨酸消旋[8]和晚期糖基化終末產(chǎn)物[9]與年齡的相關(guān)性進(jìn)行研究，但是利用這些生物分子標(biāo)志物進(jìn)行年齡推斷的準(zhǔn)確性和實(shí)用性都相對(duì)較低，不適用于法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)[10]。在近期的法醫(yī)學(xué)年齡推斷研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)血液DNA中的部分甲基化位點(diǎn)包含了豐富的年齡信息生物標(biāo)志物。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾[11-12]，與衰老之間存在密切的相關(guān)性[13]，DNA甲基化在機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育和衰老過(guò)程中存在著動(dòng)態(tài)變化過(guò)程?；蛐酒拖乱淮鷾y(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，促進(jìn)了全基因組范圍的甲基化檢測(cè)，基因組DNA甲基化總體水平隨年齡增加而降低，部分位點(diǎn)的甲基化水平卻隨年齡增加而升高，并且發(fā)現(xiàn)特定位點(diǎn)的DNA甲基化與年齡呈現(xiàn)線(xiàn)性相關(guān)性，可據(jù)此構(gòu)建年齡推斷模型預(yù)測(cè)個(gè)體年齡[14-19]。本研究通過(guò)系統(tǒng)研究甲基化位點(diǎn)與年齡的相關(guān)性，建立基于DNA甲基化的中國(guó)北方漢族男性年齡推斷算法模型。

1 材料與方法

1.1 樣本

根據(jù)知情同意原則，采集河南、山東、北京共476份漢族男性（年齡15～75歲，根據(jù)采集人員提供的戶(hù)口出生年月及采集日期確定樣本年齡）無(wú)關(guān)個(gè)體的新鮮外周靜脈血，其中國(guó)家人類(lèi)遺傳資源共享服務(wù)平臺(tái)（YCZYPT[2017]01-3）176份、中國(guó)典型人群法醫(yī)分子畫(huà)像人群隊(duì)列研究（2017JB025）150份、本課題組采集150份。盡量每個(gè)年齡樣本都選取，并盡可能保持每個(gè)年齡段樣本量大致相同，且樣本在河南、山東、北京3個(gè)地區(qū)都有分布，保證模型的適用性。不同年齡段樣本人數(shù)見(jiàn)表1。

表1 各年齡段樣本人數(shù) （N=476）

1.2 樣本制備

為驗(yàn)證模型對(duì)血斑的適用性和重復(fù)性，隨機(jī)選取15份山東血液樣本，各取100 μL涂在FTA血樣采集卡上制作成血斑樣本，室溫放置3個(gè)月后提取DNA。外周靜脈血按照QIAampDNA Blood Midi試劑盒（100）（德國(guó)Qiagen公司）說(shuō)明書(shū)提取血液DNA；血斑樣本按照MagAttract M48 DNA Manual試劑盒（200）（1064605，德國(guó)Qiagen公司）說(shuō)明書(shū)提取血斑DNA，使用NanoDrop 2000c分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific公司）對(duì)DNA濃度進(jìn)行定量。

1.3 候選位點(diǎn)選擇與引物設(shè)計(jì)

結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)和基于前期研究[1，18，20-29]篩選位點(diǎn)，從中選擇21個(gè)與年齡高度相關(guān)的位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)所在的序列都從UCSC genome browser（https://genome.ucsc.edu/）中下載，選擇距離目標(biāo)胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤（cytosine-phosphate-guanine，CpG）位點(diǎn)上下游各約200 bp的長(zhǎng)度，共401 bp長(zhǎng)度DNA片段，并下載DNA片段，使用美國(guó)Agena公司的Agena Bioscience EpiDesigner（http://www.epidesigner.com/）在線(xiàn)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物解鏈溫度（melting temperature，Tm）約為60℃。

1.4 EpiTYPER檢測(cè)DNA甲基化

取 1 μg全基因組 DNA，按照 EZ DNA MethylationTM試劑盒（美國(guó)Zymo Research公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行重亞硫酸鹽處理，轉(zhuǎn)化條件：95℃ 30s，50℃ 15min；20個(gè)循環(huán)。20 μL水洗脫獲得轉(zhuǎn)化后的DNA。同時(shí)設(shè)置兩個(gè)對(duì)照：完全甲基化的DNA和完全未甲基化的DNA（甲基化程度分別為100%和0%）。

PCR擴(kuò)增體系5μL，包括1μL重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后DNA，1.37μL不含RNA酶的水，0.5μL 10×PCR緩沖液，0.09 μL PCR酶，0.04 μL dNTP混合物，2.0 μL引物混合物包括上下游引物（1μmol/L）。熱循環(huán)參數(shù)：95℃ 4min；94℃ 20s，56℃ 30s，72℃ 60s，45個(gè)循環(huán)；72℃ 3min。多余的核苷酸將在下步純化反應(yīng)中被除去，純化體系為2μL，包括1.7μL不含RNA酶的水和0.3 μL 1.7 U/μL蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）。然后，孵化 37℃ 20 min，85℃5 min。純化后，用1.5%的瓊脂糖凝膠跑膠，取3 μL SAP產(chǎn)物，上樣緩沖液2 μL，120 V電壓電泳30 min。下一步進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和T裂解，體系為不含RNA酶的水3.15 μL，5×T7 RNA和DNA聚合酶緩沖液0.89 μL，T裂解轉(zhuǎn)錄混合物0.24 μL，二硫蘇糖醇（100 mmol/L）0.22μL，T7 RNA和DNA聚合酶0.44μL，核糖核酸酶A（10 mg/mL） 0.06 μL，純化產(chǎn)物2 μL。37℃孵育3 h。最后每個(gè)樣本中再加入43 μL不含RNA酶的水和6mg清潔樹(shù)脂并且在混勻儀上旋轉(zhuǎn)15min，以離心力10 000×g離心6 min，用MassARRAY系統(tǒng)（美國(guó)Agena Bioscience公司）進(jìn)行檢測(cè)。

對(duì)15份制作血斑的血液樣本進(jìn)行2次重復(fù)性驗(yàn)證時(shí)，分別進(jìn)行2次重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化并進(jìn)行后續(xù)的PCR擴(kuò)增及質(zhì)譜檢測(cè)，以保證所有步驟都進(jìn)行2次重復(fù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

分析與計(jì)算使用R軟件（R-3.4.2），對(duì)大批量樣本檢測(cè)結(jié)果通過(guò)K最近鄰方法（K-nearest neighbor，K-NN）補(bǔ)缺（最近的10個(gè)位點(diǎn)）。對(duì)數(shù)據(jù)補(bǔ)缺用R軟件中DMwR軟件包中“impute”函數(shù)，為了評(píng)估數(shù)據(jù)補(bǔ)缺后，最終數(shù)據(jù)分析結(jié)果是否仍然可信，選擇352份沒(méi)有缺失值的樣本，每次設(shè)置不同比例的缺失值，然后進(jìn)行K-NN方法補(bǔ)缺驗(yàn)證試驗(yàn)，再用補(bǔ)缺失后的值與真實(shí)值進(jìn)行相關(guān)性分析，用Pearson相關(guān)系數(shù)評(píng)估補(bǔ)缺的可靠性，模擬的結(jié)果與實(shí)際結(jié)果有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，表明經(jīng)過(guò)補(bǔ)缺之后數(shù)據(jù)結(jié)果可信，反復(fù)1000次，求平均值。在實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)將缺失閾值設(shè)為10%、20%、30%、40%和50%（表2）5個(gè)階段，K-NN補(bǔ)缺方法推薦的臨界閾值是20%[30]，因此在本研究中也以20%定為最大缺失閾值進(jìn)行數(shù)據(jù)補(bǔ)缺，進(jìn)而獲得可靠的DNA甲基化數(shù)據(jù)。用“cor”函數(shù)，選擇與年齡相關(guān)的甲基化位點(diǎn)，將Pearson相關(guān)系數(shù)設(shè)為|r|＞0.5，選出與年齡相關(guān)的80個(gè)甲基化位點(diǎn)。然后用赤池信息量準(zhǔn)則（Akaike information criterion，AIC）結(jié)合多元線(xiàn)性回歸方法，設(shè)置P＜0.005，進(jìn)一步篩選出與年齡高度相關(guān)的22個(gè)DNA甲基化位點(diǎn)。運(yùn)用“l(fā)m”函數(shù)及“step”函數(shù)擬合多元線(xiàn)性回歸方程并求出最優(yōu)模型，最后利用“drop”函數(shù)并結(jié)合相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.005）的指標(biāo)，篩選出與年齡高度相關(guān)的8個(gè)CpG位點(diǎn)［位點(diǎn)信息通過(guò)Genome Browser Gateway獲?。ā癏uman Assembly”選為 GRCh38，https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?redirect=manual&source=genome.ucsc.edu）］，并得出與年齡相關(guān)的多元線(xiàn)性回歸模型。將篩選出與年齡高度相關(guān)的8個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化值（x）代入到年齡預(yù)測(cè)回歸模型中，得到相應(yīng)的預(yù)測(cè)年齡，并利用“plot”函數(shù)畫(huà)出預(yù)測(cè)年齡與實(shí)際年齡的散點(diǎn)圖。運(yùn)用留一法交叉驗(yàn)證方法評(píng)估模型，352份樣本數(shù)據(jù)，每次留下一個(gè)樣本作為驗(yàn)證樣本，其余樣本重新訓(xùn)練模型，這個(gè)步驟一直持續(xù)到每個(gè)樣本都被當(dāng)作一次驗(yàn)證樣本，用留一法評(píng)估模型時(shí)運(yùn)用“boot”軟件包中“c”函數(shù)。將352份樣本按實(shí)際年齡大小排列，每10歲分為一組，求每個(gè)樣本的預(yù)測(cè)年齡，并進(jìn)一步計(jì)算出每個(gè)年齡段人數(shù)的平均絕對(duì)偏差（mean absolute deviation，MAD）值。用109份樣本對(duì)年齡推斷模型進(jìn)行驗(yàn)證，將CpG位點(diǎn)的甲基化值代入到年齡推斷模型中，求出109份樣本的MAD值，驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。本研究檢測(cè)了15份血液DNA樣本，及相對(duì)應(yīng)室溫存放3個(gè)月的血斑樣本，通過(guò)SPSS 17.0，采用配對(duì)t檢驗(yàn)比較15份血液樣本與血斑樣本在8個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化結(jié)果的差異。將CpG位點(diǎn)的甲基化值代入到年齡預(yù)測(cè)模型中求出相應(yīng)的預(yù)測(cè)年齡，年齡預(yù)測(cè)誤差及15份樣本的MAD值。進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證時(shí)，將2次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的8個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化值代入年齡預(yù)測(cè)方程求出2次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的預(yù)測(cè)年齡和MAD值。

表2 K-NN補(bǔ)缺方法的準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)

2 結(jié) 果

2.1 年齡相關(guān)性位點(diǎn)篩選

為了篩選出適合推斷中國(guó)北方漢族男性年齡的DNA甲基化位點(diǎn)，本研究以EpiTYPER技術(shù)平臺(tái)為基礎(chǔ)，結(jié)合文獻(xiàn)[1，18，20-29]中已報(bào)道的及前期工作積累的血液中與年齡相關(guān)的21個(gè)位點(diǎn)，檢測(cè)了476份男性血液樣本檢測(cè)了21個(gè)擴(kuò)增片段內(nèi)的153個(gè)CpG位點(diǎn)。其中352份沒(méi)有缺失值的樣本作為訓(xùn)練集構(gòu)建年齡推斷模型，通過(guò)分析年齡與153個(gè)CpG位點(diǎn)DNA甲基化值之間的相關(guān)性，從153個(gè)候選位點(diǎn)中篩選出80個(gè)與中國(guó)北方漢族男性年齡相關(guān)的DNA甲基化位點(diǎn)，然后運(yùn)用AIC進(jìn)一步篩選CpG位點(diǎn)，結(jié)果篩選出22個(gè)與年齡相關(guān)的CpG位點(diǎn)。以P＜0.005為條件最終篩選出8個(gè)與年齡高度相關(guān)的CpG位點(diǎn)，位于7個(gè)基因片段上（表3）。

2.2 中國(guó)北方漢族男性年齡推斷模型

352份樣本作為訓(xùn)練集，基于這8個(gè)CpG位點(diǎn)（x1～x8），建立了年齡（y）推斷模型：

R2=0.93，MAD=2.69歲，其MAD的95%置信區(qū)間為[2.39，2.98]，該年齡推斷模型可以用于解釋93%的年齡變化（圖1）。

表3 篩選出8個(gè)年齡高度相關(guān)的甲基化位點(diǎn)

圖1 年齡推斷模型的預(yù)測(cè)年齡與實(shí)際年齡散點(diǎn)圖

2.3 模型評(píng)估與驗(yàn)證

留一法交叉驗(yàn)證顯示，MAD為2.76歲（圖2）。6個(gè)年齡組的分析顯示（表4），MAD值從小到大依次為45～＜55歲、15～＜25歲、35～＜45歲、25～＜35歲、55～＜65歲、65～75歲。本研究建立的基于8個(gè)CpG位點(diǎn)的年齡預(yù)測(cè)模型，在年輕組（15～＜25歲）和年長(zhǎng)組（65～75歲）中，±5年的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性分別為87.50%和78.90%，±6年的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性分別為91.76%和86.24%。

運(yùn)用109份樣本作為驗(yàn)證集，對(duì)年齡預(yù)測(cè)模型進(jìn)行驗(yàn)證，其MAD值為3.80歲（圖3）。

圖2 預(yù)測(cè)年齡與實(shí)際年齡的留一法驗(yàn)證散點(diǎn)圖

表4 不同年齡段的平均絕對(duì)偏差（N=352）

圖3 109份樣本驗(yàn)證散點(diǎn)圖

2.4 血斑結(jié)果

15份血液樣本與相應(yīng)的血斑樣本的8個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化值（表5）配對(duì)樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在CpG1和CpG5，血液與血斑樣本之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余6個(gè)CpG位點(diǎn)的血液與血斑樣本之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。使用建立的年齡推斷模型，在血液樣本和血斑樣本中預(yù)測(cè)年齡與實(shí)際年齡之間的MAD值分別為4.08歲和3.99歲。15份血液樣本和血斑樣本的年齡推斷誤差最小為0.20歲和0.93歲，最大誤差為9.84和10.12歲。

2.5 重復(fù)性初步驗(yàn)證

為了驗(yàn)證結(jié)果的重復(fù)性，對(duì)上述15份血液DNA樣本，基于模型中的8個(gè)位點(diǎn)和相同的實(shí)驗(yàn)方法，重復(fù)2次試驗(yàn)，3次結(jié)果的MAD值分別為4.08、4.68和3.93歲，MAD值波動(dòng)范圍在1歲之內(nèi)，基于8個(gè)位點(diǎn)建立的年齡預(yù)測(cè)模型結(jié)果的重復(fù)性相對(duì)較好。

表5 血液樣本與血斑樣本在8個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化值（n=15，±s）

表5 血液樣本與血斑樣本在8個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化值（n=15，±s）

注：1）與血液樣本比較，P＜0.05

血斑0.36±0.071）0.55±0.07 0.21±0.04 0.78±0.08 0.23±0.041）0.20±0.05 0.52±0.10 0.49±0.09位點(diǎn)CpG1 CpG2 CpG3 CpG4 CpG5 CpG6 CpG7 CpG8血液0.38±0.06 0.55±0.06 0.20±0.05 0.78±0.09 0.25±0.03 0.21±0.06 0.57±0.10 0.48±0.07

3 討 論

年齡推斷一直在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注。眾多研究報(bào)道顯示[1，2，22]，DNA 甲基化作為年齡預(yù)測(cè)分子標(biāo)記，在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前，大多研究[19-22]都是以歐美人群為研究對(duì)象。本研究基于EpiTYPER技術(shù)平臺(tái)，檢測(cè)了476份漢族男性樣本，運(yùn)用多元線(xiàn)性回歸方法和AIC方法構(gòu)建年齡推斷模型（R2=0.93，MAD=2.69歲）。AIC是建立在熵的概念基礎(chǔ)上，衡量統(tǒng)計(jì)模型擬合優(yōu)良性的一種標(biāo)準(zhǔn)，可以作為模型選擇的一種方法，也可以權(quán)衡所估計(jì)模型的復(fù)雜度和此模型擬合數(shù)據(jù)的優(yōu)良性，AIC越小，結(jié)果越好。該模型的8個(gè)CpG位點(diǎn)中，CpG1、CpG3、CpG5、CpG6、CpG8與年齡成正相關(guān)，隨著年齡的增長(zhǎng)，DNA甲基化程度逐漸增加；CpG2、CpG4、CpG7與年齡呈負(fù)相關(guān)，隨著年齡的增長(zhǎng)DNA甲基化呈現(xiàn)去甲基化狀態(tài)。位于6號(hào)染色體的ELOVL2基因被證明與年齡具有高度關(guān)聯(lián)性[18，20-21]，TRIM59[20]、PDE4C[21]、Clorf132[20-21]、CSNK1D[19]、RASSF5[19]基因上DNA甲基化水平都被證明與年齡具有關(guān)聯(lián)性，這些位點(diǎn)應(yīng)用于不同的年齡推斷模型中。此外，chr17：21452808[29]位置上DNA甲基化水平也被證明與年齡具有關(guān)聯(lián)性。

本研究建立的基于8個(gè)CpG位點(diǎn)的年齡預(yù)測(cè)模型，隨著年齡段的增加，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性出現(xiàn)相應(yīng)的下降，MAD值大體上逐漸增大，在年輕組（15～＜25歲）MAD值為2.42歲，在年長(zhǎng)組（65～75歲）MAD值最大為3.87歲，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期已經(jīng)報(bào)道過(guò)的結(jié)果[1，21]一致。

HANNUM等[18]基于甲基化芯片數(shù)據(jù)建立了基于71個(gè)CpG位點(diǎn)的年齡預(yù)測(cè)模型，在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集該模型的MAD值分別為3.9歲和4.9歲。WEIDNER等[22]報(bào)道了基于3個(gè)CpG位點(diǎn)的年齡預(yù)測(cè)模型，在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中MAD值分別為5.4歲和3.9歲。ZBIECPIEKARSKA等[20]建立了基于5個(gè)CpG位點(diǎn)的年齡預(yù)測(cè)模型，在訓(xùn)練集中MAD為3.4歲，在男性和女性樣本中其MAD值有稍微的差別，分別為3.7歲和3.0歲。在驗(yàn)證集中MAD為3.9歲，在男性和女性樣本中其MAD值略有差別，分別為4.0歲和3.7歲，±5年的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性為72%。PARK等[1]報(bào)道的基于3個(gè)CpG位點(diǎn)的年齡預(yù)測(cè)模型，在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的MAD值分別為3.16歲和3.35歲，±6年的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度在＜60歲分組中為77.30%，在年老組（＞60歲）為57.30%。與上述研究建立的模型相比，本研究建立的年齡預(yù)測(cè)模型準(zhǔn)確度較高。

此外，模型利用的樣本是新鮮血液檢測(cè)出的數(shù)據(jù)，而實(shí)際檢材中往往難以獲得大量血液樣本，更多的是血斑，因此需要評(píng)估血液與血斑之間是否存在顯著差異，這在實(shí)際應(yīng)用中有重要的意義。本研究檢測(cè)了15份血液樣本DNA和相對(duì)應(yīng)的室溫存放3個(gè)月的血斑DNA，MAD值分別為4.08歲和3.99歲，CpG1和CpG5的甲基化值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余6個(gè)CpG位點(diǎn)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血液樣本與血斑樣本的年齡預(yù)測(cè)誤差范圍在0～10.12歲，預(yù)測(cè)誤差相對(duì)較小。關(guān)于血斑樣本的模型優(yōu)化，需增加血斑樣本檢測(cè)數(shù)量，驗(yàn)證該模型是否適用于血斑樣本。另外，15份血液樣本進(jìn)行了3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，3次結(jié)果的MAD值相差不大，證明年齡預(yù)測(cè)模型具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性和重復(fù)性。由于建立年齡預(yù)測(cè)模型時(shí)僅使用了我國(guó)3個(gè)地區(qū)的樣本，對(duì)其他地區(qū)樣本適用性需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究運(yùn)用多元線(xiàn)性回歸方法建立的基于8個(gè)與年齡高度相關(guān)的DNA甲基化位點(diǎn)的年齡預(yù)測(cè)模型，可以作為法醫(yī)學(xué)應(yīng)用中年齡預(yù)測(cè)的一種可靠又有效的方法。年齡的正確推斷可為案件提供更多更準(zhǔn)確的偵查線(xiàn)索，縮小案件的偵查范圍，有利于案件的快速偵破。

（感謝公安部物證鑒定中心閔建雄研究員為本研究提出非常有價(jià)值的建議。）