人毛發(fā)中苯丙胺類毒品檢測方法的研究進(jìn)展

任冠恒，燕啟江，唐鷹，吳君金，張靜紅，宋健文，劉寧國

（1.廣東金域司法鑒定所，廣東 廣州 510220；2.廣東司法警官職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510430；3.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063）

苯丙胺類興奮劑是指以苯丙胺為母體結(jié)構(gòu)的一類人工合成的、具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮作用的化合物。常見的苯丙胺類興奮劑有苯丙胺（amphetamine）、甲基苯丙胺（methylamphetamine），還有苯環(huán)上和（或）其N位上被其他官能團(tuán)所取代的化合物，如3，4-亞甲二氧基安非他明（3，4-methylenedioxyamphetamine，MDA）、3，4-亞甲二氧基甲基安非他明（3，4-methylenedioxymethamphetamine，MDMA）等[1]。該類苯丙胺類興奮劑具有成癮性、中樞神經(jīng)興奮、致幻[2]等藥理、毒理學(xué)特性，已被列入聯(lián)合國禁毒條例的管制中，被認(rèn)為是非法毒品，近幾十年來其濫用在全世界范圍內(nèi)不斷增長和蔓延。近年來，國內(nèi)外毒品市場上出現(xiàn)了一類新型的、結(jié)構(gòu)和藥效與苯丙胺類興奮劑相似的藥物，稱為苯丙胺類興奮劑策劃藥。該類策劃藥為苯丙胺類化合物的β酮衍生物，具有與苯丙胺類藥物類似的刺激作用[3]。目前，我國苯丙胺類毒品的濫用已造成嚴(yán)重的社會(huì)問題，由于苯丙胺類毒品人工合成簡單，大量結(jié)構(gòu)相似的苯丙胺類新型毒品泛濫于各種娛樂場所，給法醫(yī)毒物鑒定工作帶來了極大的挑戰(zhàn)。此外，該類毒品具有半衰期短、代謝速度快、體內(nèi)含量低和化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定等特點(diǎn)，而常規(guī)的毒物檢材（如血液、尿液等）僅適用于短期體內(nèi)濫用藥物的檢測，人的毛發(fā)具有易保存、穩(wěn)定、檢測時(shí)限長和分段分析可以反映較長時(shí)間的用藥史等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了體液檢材的不足[4]。本文旨在介紹近年來人毛發(fā)中苯丙胺類毒品檢測方法的主要研究進(jìn)展。

1 運(yùn)用毛發(fā)檢材的優(yōu)越性

檢驗(yàn)苯丙胺類毒品的常規(guī)檢材為體液檢材，但血液和尿液的檢材只能反映收集樣品前的1～3d苯丙胺類毒品的吸食情況[5]，不能反映長期濫用信息。而毛發(fā)檢材具有穩(wěn)定、易保存、不易作假、檢測時(shí)限長等優(yōu)點(diǎn)，可提供吸毒者吸食苯丙胺類毒品的時(shí)間和信息，越來越受到法庭科學(xué)工作者的重視[6-7]。研究[8]報(bào)道，藥物進(jìn)入毛囊細(xì)胞并不是單純靠血流中藥物的被動(dòng)擴(kuò)散，而是通過多種機(jī)制進(jìn)行的。藥物進(jìn)入毛發(fā)主要通過以下三種方式：（1）在毛發(fā)形成期，藥物通過被動(dòng)擴(kuò)散透過皮膚下的血管進(jìn)入毛囊細(xì)胞；（2）毛發(fā)形成后，藥物通過汗腺或皮脂的分泌進(jìn)入毛干；（3）毛發(fā)長出皮膚后，外界環(huán)境的污染可以將藥物帶到毛發(fā)中。藥物進(jìn)入毛發(fā)后，隨毛發(fā)的生長向前移動(dòng)，一般人的毛發(fā)生長速度大約為每月1cm[9]。大部分藥物結(jié)合毛發(fā)后可以穩(wěn)定地存在而不發(fā)生代謝，檢測時(shí)限可長達(dá)數(shù)月甚至數(shù)年。因此，通過毛發(fā)的分段分析可以大致推測過去一段時(shí)間內(nèi)吸食苯丙胺類毒品的情況。毛發(fā)分析已成為提供法庭證據(jù)的重要手段[10]。

2 毛發(fā)的前處理方法研究

2.1 清洗

毛發(fā)清洗的目的是去除外界污染以及毛發(fā)表面的污垢和油脂。外界污染是造成假陽性結(jié)果的主要原因，而毛發(fā)作為吸毒認(rèn)定的法庭證據(jù)，只是檢驗(yàn)的標(biāo)的物，僅僅考慮攝入體內(nèi)而進(jìn)入毛發(fā)的毒品，因此，毛發(fā)檢材的清洗十分重要。迄今為止，對(duì)毛發(fā)的清洗還沒有統(tǒng)一的操作規(guī)范。不同實(shí)驗(yàn)室用來清洗毛發(fā)的有機(jī)溶劑（丙酮[11]、二氯甲烷[12]、十二烷基磺酸鈉[13]、甲醇[14]等）也不盡相同，清洗方法也不統(tǒng)一。在苯丙胺類毒品進(jìn)入毛發(fā)的機(jī)制還沒有完全明確之前，無論使用哪種溶劑清洗，都無法完全去除毛發(fā)中的外源性污染。如果在清洗液中發(fā)現(xiàn)有外部污染，根據(jù)清洗動(dòng)力學(xué)可知外源性污染會(huì)因反復(fù)洗滌而被迅速清除，毛發(fā)內(nèi)部的苯丙胺類毒品也會(huì)一并洗出，故洗滌的次數(shù)一般以2～3次為宜，否則會(huì)降低毛發(fā)中苯丙胺類毒品的濃度。毛發(fā)內(nèi)部被分析物的檢出量至少要超過最后一次毛發(fā)清洗液中被分析物檢出量的10倍，則可以將外源性的污染忽略不計(jì)[15]。

2.2 研磨和水解

將毛發(fā)進(jìn)行水解能有效地將藥物釋放出來，便于后續(xù)的檢測。在水解之前，毛發(fā)一般先剪成1mm小段并進(jìn)行研磨，以增大毛發(fā)的表面積，使毛發(fā)中的藥物更大程度地釋放出來。最常用的研磨方法是利用2.5mm鎳鉻合金鋼珠與毛發(fā)一起渦旋研磨[16]，毛發(fā)越細(xì)碎越有利于提高藥物的釋放。毛發(fā)中苯丙胺類毒品的水解方法一般包括強(qiáng)酸水解、強(qiáng)堿水解、緩沖液浸泡法、酶水解和有機(jī)溶劑超聲水解等。

酸水解法一般是將毛發(fā)在鹽酸溶液中以一定的溫度孵育過夜，必要時(shí)還可以進(jìn)行振蕩或攪拌，加速毛發(fā)中藥物的溶解[17-18]。堿水解法是將毛發(fā)樣本浸泡于NaOH溶液中，并對(duì)其進(jìn)行加熱，讓毛發(fā)充分溶解，促使固化在角蛋白中的苯丙胺類毒品能夠得到完全的釋放[19-20]。與堿水解法相比，酸水解法較溫和，成本低，也能滿足苯丙胺類毒品從毛發(fā)中釋放的效率，但所需的時(shí)間較長。而堿水解法條件劇烈，可以將毛發(fā)完全消化和溶解，使毛發(fā)中的苯丙胺類毒品完全釋放，但所含的雜質(zhì)相對(duì)比較多，且容易使結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的化合物在強(qiáng)堿條件下發(fā)生降解。

緩沖液浸泡法是利用磷酸緩沖液將毛發(fā)在一定溫度和一定pH值下進(jìn)行浸泡，使毛發(fā)中的藥物溶解[21-22]。酶水解法是將毛發(fā)置于酶中低溫水浴加熱，該法在中性pH值下進(jìn)行[23-24]。這兩種方法水解條件都比較溫和，較少引起不穩(wěn)定藥物的降解，但緩沖液浸泡法使苯丙胺類毒品從毛發(fā)中釋放的效率不高，而酶水解法不僅反應(yīng)條件溫和，而且能徹底將毛發(fā)中的苯丙胺類毒品釋放，但其成本較高，且容易產(chǎn)生雜質(zhì)。

有機(jī)溶劑超聲水解法一般以甲醇為溶劑、超聲振蕩為主[25-27]。研究人員在毛發(fā)樣本中加入甲醇，在50℃的水浴中超聲溶解2h，然后以9000×g離心10min，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移到小瓶中，氮?dú)獯蹈蒣28]。該方法依靠超聲的震蕩，能將毛發(fā)中的苯丙胺類毒品釋放出來，條件溫和，最大程度地降低苯丙胺類毒品在毛發(fā)中的降解。但有機(jī)溶劑超聲水解法的缺點(diǎn)是釋放不夠完全且雜質(zhì)較多。有研究[29]考察了毛發(fā)的堿性條件水解、酸性條件水解及有機(jī)溶劑超聲提取等方法，用相同的方法萃取、檢測，通過苯丙胺類毒品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比來比較不同方法的水解效果，最后確定了將毛發(fā)在1mol/L的NaOH溶液中于75℃水浴加熱30min，在水解液中加入少許KCl，再加入氯仿溶液50 μL這種方法為最佳水解方法。

2.3 提取

含有苯丙胺類毒品的毛發(fā)經(jīng)過水解后，一般采用固相萃取和液相萃取進(jìn)行提取凈化。固相微萃?。╯olid-phase micro-extraction，SPME）技術(shù)是一種新型的樣品前處理方法。該方法是在無溶劑條件下一步完成取樣、萃取和濃縮，不但不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，而且大大簡化了樣品預(yù)處理過程，提高了分析速度和靈敏度[30]。SPME的原理是將固相萃取頭置于溶液或者頂空中，使樣品中的待測物與固相萃取頭達(dá)到平衡，這樣待測物就富集到固相萃取頭上。SPME用于苯丙胺類毒品的提取分離，通常與氣相色譜聯(lián)用，方法是待萃取頭平衡后，將其取出并插入氣相色譜汽化室，熱解吸涂層上吸附的苯丙胺類毒品。KOIDE等[31]將頂空固相微萃取技術(shù)與氣相色譜儀聯(lián)用，把毛發(fā)樣本置于75℃水浴中，用NaOH溶液進(jìn)行消化水解約5 min，待溫度降至室溫后，SPME裝置里萃取器的針頭穿過小瓶的硅橡膠聚四氟乙烯膜（polytetrafluoroethylene，PTFE），此時(shí)針頭里涂了固相微萃取涂層的萃取纖維會(huì)伸出針管，在55℃下暴露于小瓶的頂空氣體中20min，待兩相達(dá)到平衡后將萃取纖維縮回針頭，把針頭移離小瓶并快速插入到氣相色譜進(jìn)樣口的汽化室中，在220℃的溫度下將苯丙胺和甲基苯丙胺熱解吸30s。被萃取的毒品在汽化室內(nèi)解吸后，靠流動(dòng)相將其導(dǎo)入色譜柱，完成提取、分離、濃縮的全過程。該方法能快速檢測人毛發(fā)中苯丙胺與甲基苯丙胺，最低檢測限可達(dá)0.1 ng/mg和0.4 ng/mg，能有效消除雜質(zhì)的干擾及基質(zhì)的影響。

液相微萃?。╨iquid-phase micro-extraction，LPME）是液相萃取中發(fā)展最快的新技術(shù)之一，克服了傳統(tǒng)液-液萃取的繁瑣、浪費(fèi)、污染等缺點(diǎn)，具有消耗溶劑少、萃取效率高、富集倍數(shù)大、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。其基本原理是待測物在樣品與微升級(jí)的萃取溶劑之間達(dá)到分配平衡，從而實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)的微萃取[32]。近年來，LPME也有用于毛發(fā)中苯丙胺類毒品的提取，取得了不錯(cuò)的分離效果，主要包括動(dòng)態(tài)液相微萃?。╠ynamic liquidphase micro-extraction，dynamic LPME）和中空纖維液相微萃取（hollow fiber-liquid-phase micro-extraction，HF-LPME）。

Dynamic LPME是用微量進(jìn)樣器抽取一定量的溶劑，將微量進(jìn)樣器針頭浸入到含有待測物的水樣中，抽取水樣，停留一定時(shí)間，讓水樣中的待測物分配進(jìn)入進(jìn)樣器內(nèi)壁上的有機(jī)溶劑相，而后推出水樣但不推出溶劑，如此反復(fù)數(shù)次，最后將有機(jī)溶劑相進(jìn)入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀分析[33]。利用該方法檢測毛發(fā)中的苯丙胺類毒品不僅操作簡單、快速、靈敏，而且通過不斷更換水相增大了表面積，提高了萃取效率。朱丹等[34]采用堿性條件消解毛發(fā)，動(dòng)態(tài)液相微萃取的技術(shù)提取毛發(fā)中的待測物，萃取后直接吸取下層氯仿溶液，在微波條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)，然后聯(lián)合應(yīng)用GC-MS法快速檢測了毛發(fā)中4種苯丙胺類毒品，其中苯丙胺檢測限為1 ng/mg，甲基苯丙胺、3，4-（亞甲二氧基）-苯丙胺和3，4-（亞甲二氧基）-甲基苯丙胺檢測限可達(dá)500pg/mg。

HF-LPME是將多孔的中空纖維作為有機(jī)溶劑的載體，有機(jī)溶劑在纖維壁孔中形成液膜進(jìn)行傳質(zhì)，原理類似于膜分離液相萃取法，在多孔的中空纖維中進(jìn)行萃取，并不與樣品溶液直接接觸，避免了復(fù)雜樣品中基質(zhì)對(duì)分析物或萃取劑的污染[35]。該技術(shù)用于毛發(fā)中苯丙胺類毒品的提取不僅操作簡單快速、樣品前處理少，而且有機(jī)溶劑消耗少，是一項(xiàng)對(duì)環(huán)境友好的新型樣品前處理技術(shù)。DO NASCIMENTO PANTALE?O等[36]采用HF-LPME和GC-MS聯(lián)用的方法，快速地對(duì)人毛發(fā)中的苯丙胺類物質(zhì)進(jìn)行定量檢測，最低定量限均達(dá)0.05 ng/mg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于閾值（0.2 ng/mg）。該研究將毛發(fā)剪成1 mm小段后用NaOH進(jìn)行消化水解，然后置于70℃水浴中15min，冷卻至室溫，然后用中空纖維膜對(duì)被測物進(jìn)行萃取。中空纖維孔壁中填充十二烷基乙醚，作為有機(jī)中間相，而纖維膜內(nèi)腔為0.1mol/L的鹽酸，作為水相接受相。中空纖維膜利用U型裝置引入樣品溶液中，纖維膜兩端分別連接兩支微量進(jìn)樣器，方便向纖維膜內(nèi)腔中注入接受相以及萃取結(jié)束后導(dǎo)出接受相。萃取會(huì)在混勻頻率為1 000 r/min的混勻儀中進(jìn)行，45 min后萃取結(jié)束，從纖維膜中導(dǎo)出接受相，并用氮?dú)獯蹈伞４蹈珊?，殘?jiān)肰（三氟乙酸酐）∶V（乙酸乙酯）=50∶50在70℃下浸溶30min，冷卻后在40℃下用氮?dú)獯蹈桑缓笥靡宜嵋阴?fù)溶，最后，取1.0μL溶液進(jìn)樣到GC-MS系統(tǒng)中。

3 分析方法

目前，國內(nèi)外對(duì)苯丙胺類毒品的理化檢測多采用免疫分析法、GC-MS、液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatogram-mass spectrometry，LC-MS）法和毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）等方法。

免疫分析技術(shù)首次用于毛發(fā)中毒品的分析是1979年BAUMGARTNER等[37]用放射性免疫法成功測試了吸毒者毛發(fā)中的海洛因及其代謝物，并推斷吸毒者的用藥時(shí)段。此后，科學(xué)研究者對(duì)免疫分析技術(shù)進(jìn)行不斷地研究，目前，在毒品分析中應(yīng)用最多的是熒光偏振免疫分析（fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA）法。FPIA是使用熒光基團(tuán)代替放射性同位素作為標(biāo)記物，屬于競爭性的免疫分析方法，檢測熒光標(biāo)記抗原在結(jié)合特異性的抗體前后熒光偏振（fluorescence polarization，F(xiàn)P）值的變化[38]。CHEONG等[39]應(yīng)用FPIA成功篩選出頭發(fā)中的甲基苯丙胺。研究人員用甲醇潤濕紙巾后將毛發(fā)拭擦兩遍，揮干后將毛發(fā)剪成5 mm小段，并浸入酶消化液中，在56℃下水解不超過4h。毛發(fā)消化完全后將溫度升至100℃，保持1 min，使酶失去活性。溶液冷卻至室溫后，離心，取上清液進(jìn)行FPIA分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)PIA篩選方法的真陽性率為100%，真陰性率為96.7%，F(xiàn)PIA和GC-MS之間的相關(guān)系數(shù)為0.91。該方法檢測毛發(fā)中的苯丙胺類毒品，不但重復(fù)性好，而且靈敏度和特異性接近色譜水平，是一種快速可靠的免疫分析法。

氣相、液相色譜的快速普及，大大推動(dòng)了毛發(fā)分析的發(fā)展。特別是GC-MS和LC-MS法因其靈敏度高和準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，已成為檢測毛發(fā)中苯丙胺類毒品的主要方法。GC-MS發(fā)展較早，也較為成熟，分析速度快，而且有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，是較為常用和理想的分析方法。該法利用氣相色譜的高效分離性和質(zhì)譜的高靈敏性，對(duì)易揮發(fā)、極性小、熱穩(wěn)定性好的物質(zhì)實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的分析。而LC-MS則適用于極性較大，較難氣化以及熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。苯丙胺類毒品有兩種光學(xué)異構(gòu)體，分別為L-型和D-型，目前毒品市場大部分為D-型的異構(gòu)體，其不但半衰期長，而且對(duì)人體大腦中樞神經(jīng)的興奮作用大大強(qiáng)于L-型，因此，將苯丙胺類毒品的兩種光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行分離鑒別有重要的意義。有文獻(xiàn)[40]報(bào)道，用pH=10的飽和碳酸鹽緩沖液對(duì)毛發(fā)中的苯丙胺及其類似物進(jìn)行超聲萃取，加入衍生化試劑三氟乙酰-脯氨酰氯，然后用己烷直接提取，再利用GC-MS法在SIM模式下對(duì)苯丙胺及其類似物的R和S構(gòu)型的對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行快速分離和檢測，苯丙胺、甲基苯丙胺和MDA的最低檢測限可達(dá)0.1 ng/mg，而MDMA和亞甲二氧基乙基苯丙胺（methylendioxy ethylamphetamine，MDEA）最低檢測限達(dá)0.2ng/mg，建立了一種快速、高效的從毛發(fā)中分離并檢測苯丙胺類對(duì)映異構(gòu)體的分析方法。SHU等[41]把毛發(fā)浸泡在0.1 mol/L的HCl中以53℃消化過夜，采用固相萃取的方式將毛發(fā)中的甲基苯丙胺提取分離，萃取液經(jīng)過衍生化后利用非手性液相色譜柱-串聯(lián)質(zhì)譜的方法直接分離和檢測毛發(fā)中甲基苯丙胺的對(duì)映異構(gòu)體。該方法只需通過獲得R構(gòu)型與S構(gòu)型甲基苯丙胺的比例就能推導(dǎo)出組成百分比，無需將每個(gè)對(duì)映體進(jìn)行定量，是一種低成本、快速、高效的分析方法。

除了LC-MS和GC-MS等應(yīng)用較廣泛的分析方法，CE法是根據(jù)待測組分的分子量和帶電荷量，在電場驅(qū)動(dòng)力的作用下達(dá)到富集和分離，最后經(jīng)檢測器檢驗(yàn)分析的一種方法。CE分離效率高，易于操作，也被成功地用于毛發(fā)中苯丙胺類毒品的檢測。孟品佳[42]建立了毛細(xì)管區(qū)帶電泳的在線場放大樣品堆積法成功分析毛發(fā)中的苯丙胺類毒品，該方法利用緩沖體系與樣品溶液體系電導(dǎo)率的差異，實(shí)現(xiàn)樣品在毛細(xì)管中的濃縮。在實(shí)驗(yàn)中，研究者在樣品與緩沖液間引入了一水柱，水柱的電導(dǎo)率低于緩沖液，樣品隨溶液進(jìn)入后，由于樣品溶液和水柱的電阻大，形成高電場，樣品離子迅速遷移至水柱與緩沖液的界面，并在界面富集。利用該方法對(duì)4種苯丙胺類毒品進(jìn)行了分離和定量測定，檢測靈敏度提高約1000倍。GOTTARDO等[43]采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳-電噴霧電離-離子阱質(zhì)譜（capillary zone electrophoresis-electrospray ionizationion trap mass spectrometry，CZE-MS）的方法快速分析了人毛發(fā)中的苯丙胺類毒品。將剪碎的毛發(fā)樣本在0.1mol/L的HCl中45℃消化過夜，用NaOH中和后進(jìn)行液-液萃取，收集有機(jī)層并用氮?dú)饬鞔蹈珊?，用雙蒸水將殘?jiān)鼜?fù)溶。毛細(xì)管區(qū)帶電泳技術(shù)是用裸露的熔融石英毛細(xì)管實(shí)現(xiàn)分離的，以pH=9.5、濃度為25 mmol/L的甲酸銨作為緩沖液，電泳電壓為15 kV，在場放大樣品堆積的條件下，以7 kV的電動(dòng)進(jìn)樣電壓維持30 s，實(shí)現(xiàn)待測物的分離。分離結(jié)果顯示，MDA和MDMA在20 min內(nèi)完成分離，最低檢測限低于0.1ng/mg。

4 小 結(jié)

毛發(fā)作為繼血液、尿液之后特殊的生物檢材，已成為法醫(yī)毒物分析的常規(guī)檢材，并已得到法庭的承認(rèn)和采納。毛發(fā)的前處理方法經(jīng)過前人不斷的深入研究，對(duì)毛發(fā)中苯丙胺類藥物的提取分離取得了不錯(cuò)的成績，檢測分析也從最初的免疫分析法到現(xiàn)在的色譜-串聯(lián)質(zhì)譜等方法，經(jīng)過幾十年的快速發(fā)展，其結(jié)果更加準(zhǔn)確、靈敏，并逐步實(shí)現(xiàn)了系統(tǒng)化和規(guī)范化。但毛發(fā)分析畢竟是一項(xiàng)年輕的鑒定技術(shù)，毛發(fā)中苯丙胺類毒品分析研究還需要不斷的優(yōu)化和探索，為禁毒執(zhí)法工作提供有力的技術(shù)支撐。