五味子中五味子醇甲提取純化工藝的優(yōu)化

牟倩倩， 馬祖兵， 孫 強(qiáng)， 趙甜甜， 謝 龍， 李 化， 李小芳?

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室——省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川成都611137；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700）

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)，習(xí)稱(chēng)北五味子，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心之功效[1］。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，五味子木脂素類(lèi)成分是五味子主要活性成分，以含有量較高的五味子醇甲為代表，具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞、保肝等多種藥理活性，對(duì)肝炎、腦病等有良好的治療作用[2-6］，2015版 《中國(guó)藥典》也將其作為該藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)成分。目前雖有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了五味子醇甲的提取純化工藝[7］，但傳統(tǒng)方法 （煎煮法、滲漉法、回流法、乙醇沉淀法），普遍存在費(fèi)時(shí)、效率低、樣品雜質(zhì)多等問(wèn)題；雖新技術(shù) （微波提取法、超臨界提取法、高速逆流色譜法等）提高其提取純化效果，但設(shè)備成本較高，操作繁瑣，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

超聲提取法是通過(guò)超聲波所具有的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)來(lái)提高溶劑分子運(yùn)動(dòng)速度及穿透力，用于提取中藥有效成分的一種新技術(shù)，以提取溫度低、時(shí)間短、提取率高的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在中藥提取中得到廣泛應(yīng)用。大孔樹(shù)脂是一種同時(shí)具備吸附及篩選功能的高分子聚合物，因其理化性質(zhì)穩(wěn)定、不受無(wú)機(jī)物影響、交換速度快、易解吸、再生處理簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜等諸多優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于中藥活性成分的分離純化。因此，本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化五味子中五味子醇甲提取純化工藝，旨在為其他五味子木脂素類(lèi)成分的提取純化提供參考，也為相關(guān)制劑的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀 （日本島津公司）；KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q型超純水制備儀（美國(guó)Millipore公司）；FW80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；BT125D型電子天平 （德國(guó)Sartorius公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海愛(ài)朗儀器有限公司）；離心機(jī) （德國(guó)Eppendorf公司）；THZ-22型恒溫?fù)u床 （太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；玻璃層析柱 （內(nèi)徑1.2 cm×40 cm）。

1.2 試藥 五味子購(gòu)于北京同仁堂藥房，經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所李化副研究員鑒定為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.） Baill.的干燥成熟果實(shí)。五味子醇甲對(duì)照品購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司 （含有量＞99%，批號(hào)MUST-15041804）。AB-8、LX-22、X-5等大孔樹(shù)脂均購(gòu)于鄭州勤實(shí)科技有限公司 （批號(hào)20160526）。甲醇為色譜純 （美國(guó)Fisher公司）；氫氧化鈉、鹽酸、無(wú)水乙醇等均為分析純。

2 五味子醇甲提取工藝優(yōu)化

2.1 含有量測(cè)定 參照2015版 《中國(guó)藥典》五味子項(xiàng)下含有量測(cè)定方法[1］，以五味子醇甲含有量為橫坐標(biāo) （X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y）進(jìn)行回歸，得到回歸方程為Y＝21 468X+8 548.6（R2＝0.999 8）， 在 7.725～92.70 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn) 考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù) （40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）、料液比（1 ∶5、 1 ∶10、 1 ∶20、 1 ∶30、 1 ∶40、 1 ∶50）、超聲時(shí)間 （5、 10、 20、 30、 40、 50 min）、 超聲溫度 （20、30、40、50、60、70℃） 對(duì)五味子醇甲提取率的影響，重復(fù)2次，初始條件設(shè)置為料液比1∶40，超聲時(shí)間20 min，提取溫度30℃，超聲功率100 W，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可知，單因素試驗(yàn)中最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，料液比1∶10，提取時(shí)間20 min，提取溫度40℃。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù) （A）、提取時(shí)間 （B）、提取溫度 （C）作為影響因素，五味子醇甲提取率（Y）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)3因素3水平 （共17組試驗(yàn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)為中心點(diǎn)）響應(yīng)面試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 提取工藝因素水平Tab.1 Factors and levels for extraction technique

圖1 各因素對(duì)五味子醇甲提取率的影響Fig.1 Effects of various factors on schisandrin extraction rate

表2 提取工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Design and results of tests for extraction technique

然后，通過(guò)Design Expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得二次多項(xiàng)回歸方程為Y＝0.55-0.016A+0.028B+0.019C-7.5×10-3AB-1.000×10-3AC+2.5×10-3BC-0.013A2-5.5×10-3B2-3.000×10-3C2， 方差分析見(jiàn)表3。由表可知，模型P＜0.01，表明模型顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05，表明模型擬合度良好；校正決定系數(shù)0.923 2，表明92.32%的響應(yīng)值變化可用該模型來(lái)解釋?zhuān)灰蛩谹、B、C對(duì)五味子醇甲提取率均有極顯著影響 （P＜0.01），影響程度依次為 B＞C＞A。

表3 提取工藝方差分析Tab.3 Analysis of variance for extraction technique

響應(yīng)面分析見(jiàn)圖2，可知最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)81.06%，提取時(shí)間13.96 min，提取溫度39.61℃，料液比 1∶10，五味子醇甲提取率0.581%，考慮到實(shí)際操作的可行性，將其修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)81.00%，提取時(shí)間14 min，提取溫度40℃，料液比1∶10。按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行5批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得五味子醇甲提取率為0.587%，與預(yù)測(cè)值0.581%相當(dāng) （偏差0.71%），表明該工藝準(zhǔn)確可靠。

3 五味子醇甲純化工藝優(yōu)化

3.1 樣品溶液制備 稱(chēng)取五味子干燥粉末適量，按最優(yōu)提取工藝提取五味子醇甲，合并濃縮提取液，適量去離子水定容，即得，并測(cè)定其質(zhì)量濃度C0。

圖2 各因素響應(yīng)面圖 （提取工藝）Fig.2 Response surface plots for various factors（extraction technique）

3.2 樹(shù)脂型號(hào)篩選 精密稱(chēng)取預(yù)處理后的7種大孔樹(shù)脂（ AB-8、 X-5、 D-101、 LX-22、 LX-68、HPD450、LSA-21）各1.0 g，置于125 mL具塞磨口三角瓶中，加入已測(cè)定質(zhì)量濃度的樣品溶液30 mL（V1） 于搖床中，在25℃、80 r／min下吸附12 h以達(dá)到飽和，減壓抽濾，測(cè)定濾液中五味子醇甲質(zhì)量濃度C1。將充分吸附后的大孔樹(shù)脂用蒸餾水清洗至表面無(wú)樣品溶液殘留，抽濾，置于具塞磨口三角瓶中，加入 95%乙醇 50 mL（V2），25℃下振蕩12 h（80 r／min），測(cè)定解吸液中五味子醇甲質(zhì)量濃度C2，計(jì)算樹(shù)脂對(duì)該成分的吸附率及解吸率，公式分別為吸附率＝[（C0-C1） V1／C0V1]×100%、解吸率＝[C2V2／（C0-C1）V1］×100%，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知，AB-8大孔樹(shù)脂對(duì)五味子醇甲的吸附率和解吸率均最高，與前期報(bào)道[8］一致，故選擇其進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖3 大孔樹(shù)脂吸附率及解吸率Fig.3 Adsorption and desorption rates of macroporous resins

3.3 上樣液質(zhì)量濃度考察 取經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔樹(shù)脂5 g，濕法上柱，配制0.05、0.1、0.2、0.3、 0.4 g／mL樣品溶液， 以 2 mL／min體積流量動(dòng)態(tài)吸附，待上柱樣品溶液全部通過(guò)樹(shù)脂柱后收集流出液，測(cè)定五味子醇甲質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附率，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可知，隨著上樣質(zhì)量濃度增加吸附率先增加后降低，在0.1 g／mL時(shí)最高，故確定上樣液質(zhì)量濃度為0.1 g／mL。

圖4 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響Fig.4 Effect of sample concentration on adsorption rate

3.4 上樣液體積流量考察 取經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔樹(shù)脂5.0 g，濕法上柱，將1.0 g／mL樣品溶液以0.5、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0 mL／min體積流量上樣吸附，收集過(guò)柱殘液，測(cè)定五味子醇甲質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附率，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖可知，上樣液體積流量在0.5～1.0 mL／min之間時(shí)吸附率變化不大，之后隨著其增加而逐漸降低，為縮短純化周期，故確定上樣液體積流量為1.0 mL／min。

圖5 上樣液體積流量對(duì)吸附率的影響Fig.5 Effect of sample volumetric flow rate on adsorption rate

3.5 上樣液用量考察 取經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔樹(shù)脂5.0 g，濕法裝柱，將0.1 g／mL樣品溶液以1.0 mL／min體積流量連續(xù)上樣，流出液每20 mL收集1管，測(cè)定五味子醇甲質(zhì)量濃度，繪制泄漏曲線，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖可知，隨著上樣液用量增加流出液中泄漏的五味子醇甲含有量也隨之增加，達(dá)到160 mL時(shí)該成分明顯泄露，達(dá)到180 mL時(shí)其質(zhì)量濃度已超過(guò)初始的10%，故確定上樣液用量為160 mL。

圖6 上樣液用量對(duì)五味子醇甲質(zhì)量濃度的影響Fig.6 Effect of sample consumption on schisandrin concentration

3.6 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)考察 取經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔樹(shù)脂5.0 g，濕法裝柱，將0.1 g／mL樣品溶液以1.0 mL／min體積流量上樣吸附，先用2 BV去離子水沖洗除雜，再用 30%、50%、70%、80%、95%乙醇各50 mL以1 mL／min體積流量洗脫，收集洗脫液，測(cè)定五味子醇甲質(zhì)量濃度，計(jì)算解吸率，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖可知，隨著洗脫劑體積分?jǐn)?shù)增加解吸率不斷增加，在80%時(shí)最高，之后逐漸下降，故確定洗脫劑體積分?jǐn)?shù)為80%。

圖7 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響Fig.7 Effect of eluent concentration on desorption rate

3.7 洗脫劑體積流量考察 取經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔樹(shù)脂5.0 g，濕法裝柱，將0.1 g／mL樣品溶液以1.0 mL／min體積流量上樣吸附，先用2 BV去離子水沖洗除雜，再用50 mL 80%乙醇以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL／min體積流量洗脫，收集洗脫液，測(cè)定五味子醇甲質(zhì)量濃度，計(jì)算解吸率，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖可知，隨著洗脫劑體積流量增加解吸率先稍有增加再緩慢下降，在2.0 mL／min時(shí)最高，故確定洗脫劑體積流量為2.0 mL／min。

圖8 洗脫劑體積流量對(duì)解吸率的影響Fig.8 Effect of eluent volumetric flow rate on desorption rate

3.8 洗脫劑用量考察 取經(jīng)預(yù)處理后的AB-8大孔樹(shù)脂5.0 g，濕法裝柱，將0.1 g／mL樣品溶液以1.0 mL／min體積流量上樣，先用2 BV去離子水洗滌，再用80%乙醇以2.0 mL／min體積流量洗脫，分段收集洗脫液，每份10 mL，測(cè)定五味子醇甲質(zhì)量濃度，繪制洗脫曲線，結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖可知，當(dāng)洗脫劑用量達(dá)到50 mL時(shí)五味子醇甲基本洗脫完全，為更加充分地洗脫，故確定洗脫劑用量為60 mL。

圖9 洗脫劑用量對(duì)五味子醇甲質(zhì)量濃度的影響Fig.9 Effect of eluent consumption on schisandrin concentration

3.9 Box-Behnken響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇上樣液質(zhì)量濃度 （A）、洗脫劑體積分?jǐn)?shù)（B）、洗脫劑用量 （C）作為影響因素，五味子醇甲收率 （Y，吸附率×解吸率）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken中心試驗(yàn)方案進(jìn)行3因素3水平設(shè)計(jì)。因素水平見(jiàn)表4，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 純化工藝因素水平Tab.4 Factors and levels for purification technique

然后，通過(guò)Design Expert軟件對(duì)表5數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得二次多項(xiàng)回歸方程為Y＝90.94-4.51A+3.27B+1.63C-0.002 5AB+0.11AC-2.41BC+1.55A2-8.64B2-5.24C2，方差分析見(jiàn)表6。由表可知，模型P＜0.01，表明模型顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05不顯著，表明模型擬合程度良好；校正決定系數(shù)0.973 0，表明97.30%的響應(yīng)值變化可用該模型來(lái)解釋?zhuān)灰蛩谹、B、C、BC、A2、B2、C2對(duì)五味子醇甲收率有顯著影響 （P＜0.05），影響程度依次為A＞B＞C。

表5 純化工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.5 Design and results of tests for purification technique

表6 純化工藝方差分析Tab.6 Analysis of variance for purification technique

響應(yīng)面分析見(jiàn)圖10，可知最優(yōu)純化工藝為上樣液質(zhì)量濃度 0.06 g／mL，洗脫劑體積分?jǐn)?shù)84.35%，洗脫劑用量61.98 mL，五味子醇甲收率95.155%，考慮到實(shí)際操作可行性，將其修正為上樣液質(zhì)量濃度0.06 g／mL，洗脫劑體積分?jǐn)?shù)85%，洗脫劑用量62 mL。按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得五味子醇甲收率為94.51%，與預(yù)測(cè)值95.155%相當(dāng) （偏差 0.33%），同時(shí)含有量為46.54%，表明該工藝準(zhǔn)確可靠。

圖10 各因素響應(yīng)面圖 （純化工藝）Fig.10 Response surface plots for various factors （purification technique）

4 討論

王磊[9］對(duì)五味子醇甲超聲提取工藝進(jìn)行研究，但僅考察了提取溶劑、料液比、超聲功率3個(gè)因素。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上補(bǔ)充了提取時(shí)間、提取溫度，使該工藝條件更系統(tǒng)，而且優(yōu)化所得提取溶劑、料液比及該條件下五味子醇甲提取率與該報(bào)道一致，表明該結(jié)果準(zhǔn)確可靠。李洪洋等[10］對(duì)五味子醇甲大孔樹(shù)脂純化工藝進(jìn)行研究，但僅采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化上樣液質(zhì)量濃度等幾種參數(shù)，而且未測(cè)定吸附率、解吸率、收率、含有量等，本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面法考察影響其純化效果的工藝條件，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具體準(zhǔn)確。

同時(shí)，本研究比較了甲醇和乙醇作為提取溶劑對(duì)五味子醇甲提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)后者效果稍優(yōu)，同時(shí)考慮到工業(yè)生產(chǎn)中它相對(duì)更加安全、便宜，故選擇乙醇作為提取溶劑。