醒腦靜注射液組分促進缺氧復氧膠質(zhì)細胞清除胞外谷氨酸提高缺氧神經(jīng)元活力的研究*

柴麗娟 ，徐 耀 ，黃菊陽 ，2，李芮琳 ，郭 虹 ，王少峽 ，2，胡利民

（1．方劑學教育部重點實驗室，天津 301617；2．天津市中藥藥理學重點實驗室，天津 301617；3．天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 301617）

醒腦靜注射液（XNJI）由麝香、冰片、郁金、梔子4味藥經(jīng)加工提取制備而成，由安宮牛黃丸精制而來，注射液中含有β-欖香烯、麝香酮、吉馬酮、莪術(shù)烯酮、莪術(shù)二酮、樟腦、龍腦、冰片等多種成分，主用于氣血逆亂，腦脈瘀阻所致中風昏迷，偏癱口等。臨床上XNJI可以改善缺血區(qū)供氧供血，增強腦細胞活力和耐缺氧能力[1-2]。減輕大面積腦梗死后繼發(fā)的腦水腫[3]，降低腦梗死患者的炎癥因子表達[4]，改善患者的記憶功能與生活能力[5]。體外研究發(fā)現(xiàn)醒腦靜提高氧糖剝奪損傷后血管內(nèi)皮細胞存活，降低內(nèi)皮細胞的炎癥反應等[6]。雖然有很多XNJI在臨床和動物腦中風中的研究，但在體外對其組分治療中風研究機制還有待補充。

膠質(zhì)細胞在腦組織損傷或缺血時發(fā)生激活，表現(xiàn)為細胞體積變大、數(shù)量增多和GFAP表達增加等一系列形態(tài)和功能的變化[7]。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，負責神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及維持突觸可塑性。在腦中風等病理狀態(tài)下，胞外谷氨酸濃度異常升高，可導致神經(jīng)元內(nèi)Ca2+超載，潰變，死亡，產(chǎn)生谷氨酸興奮毒性[8]。因此迅速有效地將突觸間隙的高濃度谷氨酸清除有利于維持正常的突觸傳遞功能。星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元相比較，具有更大的谷氨酸攝取能力[9]。生理狀態(tài)下膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元起到支撐、保護的作用；腦缺血過程中，膠質(zhì)細胞也可以保護神經(jīng)元，提高神經(jīng)元的存活率[10]。綜上，研究以XNJI的8種成分為研究對象，探討其對Hypo/Reox后膠質(zhì)細胞胞外高濃度谷氨酸的清除能力。因膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元具有支持保護作用[10]，研究同時利用各組分處理的膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)Hypo/Reox后神經(jīng)元細胞，研究其對神經(jīng)元活力的影響，以期為XNJI治療腦中風提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 Wistar乳鼠購自北京維通利華；DMEM/F12 培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素、0．125%胰蛋白酶（Gibco，美國）；Anti-GFAP（CST，Danvers，MA）；谷氨酰胺、dBcAMP、Glutamate Assay Kit（Sigma，美國）；FBS（BI，以色列）；Cell Counting Kit-8（日本同仁化學研究所，日本）；BCA蛋白濃度測定（索來寶，中國）；PC12神經(jīng)元細胞株（由中國醫(yī)學科學院藥物研究所陳乃宏課題組惠贈）。

1.2 原代星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)和純化 取1～2 d Wistar大鼠乳鼠腦組織，無菌條件下置于冷HBSS中。用眼科鑷小心去除腦膜及大血管，剝離皮質(zhì)于預冷的DMEM/F12培養(yǎng)基中，剪成1 mm3大小乳糜狀，0．25%胰酶37℃震蕩消化10 min后，用含10%FBS的DMEM/F12稀釋終止消化。輕吹混勻后4℃、1 000 r/min離心10 min，棄去上清，用DMEM/F12重懸細胞，75 μm 篩網(wǎng)過濾，收集濾液；4℃，1 000 r/min離心10 min收集沉淀，用DMEM/F12全培基（20%FBS，1%谷氨酰胺，1%雙抗）重懸細胞，調(diào)細胞密度至5×105個/mL種植于75 cm2的培養(yǎng)瓶中。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱差速貼壁1 h，而后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至新的75 cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。細胞每3天半量換液1次。待細胞生長至融合時純化。純化時首先將細胞放于氣浴搖床，260 r/min、37℃，振搖2 h棄去培養(yǎng)液以去除小膠質(zhì)細胞。而后加入新培養(yǎng)液260 r/min，37℃振搖18 h去除少突膠質(zhì)細胞，18 h后細胞進行傳代備用。用膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）免疫熒光鑒定體外培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細胞。實驗選用穩(wěn)定的第2代到第4代細胞。

1.3 膠質(zhì)細胞缺氧復氧模型的建立 將膠質(zhì)細胞以 2．2×104個/cm2種入 96 孔板中，組別分為 3 組，覆蓋約有70%～80%時，用無血清培養(yǎng)基半量置換培養(yǎng)液2次進行同步化處理，2次置換間隔超過4 h。而后細胞進行缺氧模型的建立：

1）對照組（Control）：細胞同步化 1 d 后，細胞培養(yǎng)液置換為含5%FBS的DMEM/F12全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，而后用磷酸鹽緩沖液（PBS）輕洗細胞2次后，用5%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基于5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，3 h或4 h，而后置換為新的含5%的DMEM/F12全培養(yǎng)液，5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，3 h或4 h。

2）缺氧復氧組（Hypo/Reox組）：細胞同步化1 d后，細胞用含0．062 5 mmol/L dBcAMP的5%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基進行活化48 h。48 h后用預先通10 min 95%N2+5%CO2的HBSS液洗滌細胞2次，而后將細胞浸泡于該HBSS中，放入缺氧小室，缺氧小室中充滿95%N2+5%CO2的氣體后密封缺氧小室，放入37℃孵箱中培養(yǎng)2 h，3 h或4 h。缺氧結(jié)束后打開缺氧小室，取出培養(yǎng)板，棄去HBSS，置換成含 0．062 5 mmol/L dBcAMP的 5%血清的 DMEM/F12全培養(yǎng)液，5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，3 h或4 h，進行復氧。

3）配制CCK-8工作液（10%CCK-8原液與90%含5%FBS的DMEM/F12）：將上述缺氧復氧結(jié)束的細胞更換為CCK-8工作液，37℃避光孵育30 min后，酶標儀560 nm測定吸光度，判定細胞活力。

1.4 細胞外谷氨酸清除模型的建立 正常培養(yǎng)膠質(zhì)細胞于12孔板，覆蓋約有80%～90%時，將培養(yǎng)液置換為含100 μmol/L高濃度谷氨酸的培養(yǎng)液，分別于 10 min、20 min、30 min、1 h、1．5 h、3 h 取培養(yǎng)上清液50 μL，檢測培養(yǎng)液中谷氨酸的含量。3 h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞后裂解液（0．25 mmol/L NaOH；0．1%Triton X-100）裂解細胞，用 BCA 法測定蛋白質(zhì)含量，對谷氨酸測定濃度進行校正。

按照實驗1．3部分對膠質(zhì)細胞進行缺氧4 h復氧3 h處理，復氧時在細胞培養(yǎng)液中加入谷氨酸（終濃度為100 μmol/L）。復氧3 h結(jié)束時，取膠質(zhì)細胞培養(yǎng)上清液50 μL，檢測谷氨酸濃度，作為膠質(zhì)細胞對胞外高濃度谷氨酸清除的實驗數(shù)據(jù)。同樣BCA法測定蛋白含量進行校正。

谷氨酸的含量采用sigma試劑盒進行測定：準備100μL/孔反應混合液（glutamateassaybuffer90μL，glutamateDeveloper8μL，glutamateenzymemix2μL），加入到50 μL樣品中，水平振動混勻后37℃避光孵育30 min，450 nm酶標儀檢測。

1.5 XNJI對膠質(zhì)細胞谷氨酸清除預加藥分組及谷氨酸濃度測定 將膠質(zhì)細胞以2．2×104個/cm2種入12孔板中，膠質(zhì)細胞生長至70%～80%時，細胞同步化 處 理 1 d，Hypo/Reox 組 用 含 0．062 5 mmol/L dBcAMP的5%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，藥物處理組在Hypo/Reox組基礎上加入XNJI不同的有效組分，藥物配制分組如下：1）Hypo/Reox組。2）β-欖香烯10-5mol/L組。3）麝香酮10-5mol/L組。4）吉馬酮10-5mol/L組。5）莪術(shù)烯酮10-5mol/L組。6）莪術(shù)二酮 10-5mol/L 組。7）樟腦10-5mol/L 組。8）龍腦 10-5mol/L 組。9）冰片 10-5mol/L 組。對照組，與1．3處理相同。加入藥物2 d后細胞進行缺氧4 h，4 h后將HBSS置換為含100 μmol/L高濃度谷氨酸的含藥的DMEM/F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。收集上述部分細胞培養(yǎng)上清液，取50 μL用于檢測膠質(zhì)細胞對細胞外高濃度谷氨酸清除能力的實驗數(shù)據(jù)。

1.6 醒腦靜處理膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液對體外Hypo/Reox后神經(jīng)元活力的影響 PC12細胞培養(yǎng)于DMEM（高糖）+5%胎牛血清+5%馬血清+1%雙抗培養(yǎng)液中，每 2～3 天用 0．05%胰酶消化傳代，5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的PC12細胞以6×104個/mL的密度種在 96孔板中（100 μL/孔），24 h后，缺氧組神經(jīng)元細胞換為無糖DMEM培養(yǎng)基（不含血清），置于缺氧小室中缺氧6 h，對照組細胞換為完全培養(yǎng)基（高糖DMEM加血清），放于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。6 h后缺氧組細胞置換為從1．4收取的膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液，對照組置換為來源于正常培養(yǎng)的膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液，在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。24 h后加入CCK8，450 nm讀取吸光度，進行PC12細胞活力測定。

1.7 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 18．0軟件統(tǒng)計，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)細胞培養(yǎng)鑒定 顯微鏡下觀察傳代的星型膠質(zhì)細胞折光性強，形狀不規(guī)則，主要為多角形。有多個粗短枝狀初級胞突，胞體大而扁平、胞質(zhì)豐富，6～7 d后細胞融合成單層，符合神經(jīng)膠質(zhì)細胞生長特性。培養(yǎng)的膠質(zhì)細胞經(jīng)GFAP染色后，胞漿著色（如圖1箭頭指示），細胞形態(tài)穩(wěn)定，純度高，證明培養(yǎng)的細胞為星型膠質(zhì)細胞，可用于后續(xù)實驗。

2.2 膠質(zhì)細胞缺氧/復氧時間及細胞外谷氨酸清除模型的建立 實驗進一步對膠質(zhì)細胞進行缺氧條件的摸索，從圖2A可以看出，與對照組相比，膠質(zhì)細胞經(jīng)含0．062 5 mmol/L dBcAMP和低濃度FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)后，缺氧3 h后復氧3、4 h細胞活力顯著下降。缺氧4 h，復氧2、3、4 h膠質(zhì)細胞的活力同樣顯著下降，因此后續(xù)研究選用缺氧4h作為缺氧時長。將谷氨酸加入到膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液高達100 μmol/L，檢測不同時間點膠質(zhì)細胞胞外谷氨酸濃度，從圖2B可以看出，隨著時間延長，培養(yǎng)液中谷氨酸的濃度逐漸降低，3 h后降低約50%，證明培養(yǎng)的膠質(zhì)細胞對胞外谷氨酸具有清除能力，故研究選用3 h為復氧時間點，進一步考察膠質(zhì)細胞對胞外高濃度谷氨酸清除。為了進一步驗證上述缺氧復氧時間點的有效性，從圖2C可以看出，膠質(zhì)細胞缺氧4 h/復氧3 h（Hypo 4 h/Reox 3 h）后，細胞外培養(yǎng)基中谷氨酸濃度顯著比對照組高，說明此時膠質(zhì)細胞的谷氨酸清除能力減弱。綜上，研究選用Hypo 4 h/Reox 3 h作為膠質(zhì)細胞對胞外谷氨酸清除模型研究的時間點，基于此模型對XNJI有效組分進行藥效學評價。

2.3 XNJI不同組分對膠質(zhì)細胞胞外谷氨酸清除的影響 谷氨酸的清除主要依賴膠質(zhì)細胞上的谷氨酸轉(zhuǎn)運體，逆濃度將谷氨酸轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)，清除胞外高濃度谷氨酸。從圖3可以看出，與對照組相比，Hypo 4 h/Reox 3 h組膠質(zhì)細胞胞外培養(yǎng)基中谷氨酸的濃度顯著高，說明此時膠質(zhì)細胞受損導致轉(zhuǎn)運體的功能障礙，對胞外谷氨酸的清除能力顯著降低。與Hypo 4 h/Reox 3 h組相比，XNJI有效組分β-欖香烯、吉馬酮、龍腦、冰片組胞外谷氨酸濃度顯著降低，說明4個有效成分能顯著提高Hypo 4 h/Reox 3 h后膠質(zhì)細胞對胞外高谷氨酸的清除能力。

2.4 XNJI處理膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液對Hypo 6 h/Reox 24 h神經(jīng)元活力的影響 XNJI組分處理缺氧復氧后的膠質(zhì)細胞，可以增加其對胞外高濃度谷氨酸的清除，取其培養(yǎng)基，培養(yǎng)缺氧后的神經(jīng)元（圖4A所示）。從圖4B可以看出，與對照組相比，膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液Hypo 4 h/Reox 3 h組條件培養(yǎng)液對缺氧6 h神經(jīng)元細胞活力沒有影響；與Hypo 4 h/Reox 3 h組相比，XNJI有效組分吉馬酮、龍腦、冰片處理后的條件培養(yǎng)液對缺氧后神經(jīng)元的活力有顯著提高作用，說明這3個成分可以通過缺氧后膠質(zhì)細胞對缺氧后的神經(jīng)元活力有提高作用。

3 討論

膠質(zhì)細胞在腦組織損傷或缺血時發(fā)生激活等一系列形態(tài)和功能的變化[7]。提高膠質(zhì)細胞內(nèi)cAMP濃度能夠誘導星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)變化，常用作星形膠質(zhì)細胞形態(tài)分化激活的研究模型，如在大鼠原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞，cAMP作用24 h后能夠引起細胞形態(tài)發(fā)生變化[11]。反應性星形膠質(zhì)細胞的增多可能是為了滿足星形膠質(zhì)細胞代謝活動的增加，星形膠質(zhì)細胞對腺苷與谷氨酸的代謝調(diào)節(jié)被認為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中興奮性產(chǎn)生與傳播的重要環(huán)節(jié)，在神經(jīng)元損傷后的修復保護中有重要意義[12]。因此，課題選用環(huán)磷酸腺苷誘導膠質(zhì)細胞活化同時缺氧復氧進行造模，研究表明，實驗所采用模型對缺氧復氧后膠質(zhì)細胞胞外高濃度谷氨酸的清除能力是顯著下降的，與Gouix等[13]的研究相吻合。

圖4 XNJI組分處理Hypo 4 h/Reox 3 h膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液對缺氧6 h神經(jīng)元活力的影響Fig.4 Astrocyte-conditioned medium treated by XNJI component under Hypo 4 h/Reox 3 h attenuates hypoxia 6 h neurons cell viability

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在著谷氨酸、谷氨酰胺循環(huán)，通過合成、釋放、回收發(fā)揮作用。谷氨酸經(jīng)星形膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)運攝取到胞內(nèi)，在谷氨酰胺合成酶的作用下合成谷氨酰胺，通過轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運到神經(jīng)元發(fā)揮作用，之后通過磷酸化激活的谷氨酰胺脫氨基作用又轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?，繼續(xù)參與循環(huán)[14-16]。生理狀態(tài)下谷氨酸作為信號傳導物質(zhì)，必須保持在一個低濃度水平，在信號傳導中迅速上升，隨后又恢復為較低濃度終止信號傳導。腦中風病理狀態(tài)下，谷氨酸濃度異常升高可導致神經(jīng)元過度興奮，引起神經(jīng)元產(chǎn)生谷氨酸的興奮毒性[8]。近期研究表明作為膳食補充劑的α-硫辛酸（LA）能增加C6星形膠質(zhì)細胞株谷氨酸攝取、谷氨酰胺合成酶活性和谷胱甘肽含量[17]；研究發(fā)現(xiàn)采用dBcAMP和TNF-α處理膠質(zhì)細胞，并用抑肝散處理，星形膠質(zhì)細胞中GLT-1的谷氨酸轉(zhuǎn)運功能增強[18]。本研究也用dBcAMP對膠質(zhì)細胞進行活化，研究發(fā)現(xiàn)，XNJI中有效成分β-欖香烯、吉馬酮、龍腦、冰片可以提高缺氧復氧膠質(zhì)細胞對胞外谷氨酸的清除能力，其條件培養(yǎng)液培養(yǎng)缺氧神經(jīng)元，同時，醒腦靜的有效成分吉馬酮，龍腦、冰片對缺氧后的神經(jīng)元活力有提高作用，但研究中條件培養(yǎng)液提高神經(jīng)元活力的深入機制還有待進一步探討。

綜之，XNJI組分能促進缺氧復氧膠質(zhì)細胞對谷氨酸的清除并提高神經(jīng)元活力。