摩腹手法對睡眠剝奪大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)及Orexin-A的影響*

高建輝 ，馬 艷 ，余云飛 ，劉俊昌 ，2

（1．新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊 830001；2．新疆醫(yī)科大學(xué)，烏魯木齊 830000）

失眠目前已成為嚴(yán)重影響人們身心健康和日常生活的常見疾病之一，其患病率在全球范圍內(nèi)正逐年升高，并日趨普遍化、年輕化[1-2]。最新的研究認(rèn)為，睡眠和覺醒的產(chǎn)生與維持主要依賴于腦內(nèi)的睡眠和覺醒中樞及其相應(yīng)的神經(jīng)遞質(zhì)，包括：去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、γ-氨基丁酸（GABA）等[3]。此外，下丘腦的食欲素（Orexin）系統(tǒng)也被認(rèn)為與睡眠和覺醒密切相關(guān)并發(fā)揮重要作用[4]。摩腹手法作為中醫(yī)的推拿療法，在臨床上治療原發(fā)性失眠療效確切，具有安全性高、無毒副作用及依賴性等優(yōu)勢。本研究通過觀察摩腹手法對睡眠剝奪大鼠腦內(nèi)睡眠和覺醒中樞相應(yīng)神經(jīng)遞質(zhì)及Orexin-A水平的影響，探討摩腹手法調(diào)節(jié)睡眠和覺醒的機(jī)制，為腹部推拿治療失眠提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料

1.1 動物及分組 選取Wistar大鼠共30只，雌雄各半（新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供），5～6月齡，體質(zhì)量（300±50）g，喂養(yǎng)環(huán)境保持安靜，溫度控制在18～22℃，通風(fēng)良好，自然光線。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，稱質(zhì)量編號后采用分層隨機(jī)分組分為正常對照組、模型對照組和摩腹手法組，每組10只，雌雄各半。

楊絳擔(dān)心丈夫?yàn)樨埗米锶?，便引用他自己的話勸他：“打狗要看主人面，那么，打貓要看主婦面了！”（小說《貓》的第一句）那只貓可是林徽因的貓，“打貓要看主婦面”，不要因?yàn)椤柏埵隆眰藘杉业摹昂蜌狻薄?/p>

1.2 主要試劑 戊巴比妥鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），GABA檢測試劑盒（ELISA）、DA檢測試劑盒（ELISA）、NE 檢測試劑盒（ELISA）、5-HT檢測試劑盒（ELISA）、Orexin-A 檢測試劑盒（ELISA）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)造模 針對模型對照組和摩腹手法組的大鼠進(jìn)行睡眠剝奪造模。采用改良多平臺水環(huán)境法[5]：自制 90 cm×70 cm×50 cm 的水槽作為鼠箱，其內(nèi)設(shè)10個直徑6 cm、高8 cm的圓形平臺，兩兩間隔15 cm。向水槽內(nèi)注水并使水面保持在平臺面下方約1 cm處，水溫保持約20℃。箱內(nèi)單次放入大鼠5只，確保大鼠可在平臺間自由活動。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 21．0統(tǒng)計(jì)軟件，所得計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性與方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0．05，以 P＜0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.1 造模情況 造模完成后各組大鼠戊巴比妥鈉睡眠實(shí)驗(yàn)情況見表1，造模的兩組大鼠在睡眠潛伏期和總睡眠時間方面與正常對照組相比均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05），提示造模成功。

因此，本土學(xué)者在開展工作重塑研究時，應(yīng)深入探索工作重塑行為與個人和組織創(chuàng)新績效的關(guān)系及其作用機(jī)制，促進(jìn)管理理論研究服務(wù)于我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展的現(xiàn)實(shí)需要。

2.3 取材及標(biāo)本處理 3組大鼠干預(yù)完成后，將麻醉完全的大鼠斷頭取腦，根據(jù)第6版Sprague-Dawley大鼠腦圖譜，分離出雙側(cè)下丘腦和腦干組織，稱質(zhì)量后，分別將大鼠下丘腦及腦干組織勻漿、離心，取上清液。

第三，由于各路管線眾多、管道網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，在施工過程中必須要對管線網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行統(tǒng)籌考慮，并加強(qiáng)對管線的保護(hù)和避讓，嚴(yán)格按照規(guī)范要求做好規(guī)范化施工，以確保工程質(zhì)量。

造模成功的判定：采用戊巴比妥鈉睡眠實(shí)驗(yàn)判定[6]。造模完成后，3組大鼠均腹腔注射戊巴比妥鈉（劑量為預(yù)實(shí)驗(yàn)測得引起100%大鼠睡眠的最小閾劑量），將大鼠腹部向上置于實(shí)驗(yàn)臺上，記錄大鼠的睡眠潛伏時間和睡眠時間。以翻正反射消失滿1 min為發(fā)生睡眠，以翻正反射恢復(fù)為覺醒。對正常對照組和造模兩組大鼠的睡眠潛伏時間、睡眠時間及睡眠率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，若有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），則提示造模成功。

3 結(jié)果

2.2 干預(yù)方法 將大鼠束縛于實(shí)驗(yàn)臺上，取仰臥位。摩腹手法具體操作：根據(jù)“逆摩為補(bǔ)，順摩為瀉”的原則，操作者位于大鼠左側(cè)，右手拇指末節(jié)指腹羅紋面著實(shí)于關(guān)元穴，其余四指并攏自然伸開或彎曲，通過肩關(guān)節(jié)在外前方向的小幅度環(huán)轉(zhuǎn)，帶動拇指在大鼠腹部做逆時針方向環(huán)形平移摩擦；移動范圍：上起鳩尾穴，下止關(guān)元穴，左右至雙側(cè)帶脈穴；周而復(fù)始，5～7次/min，操作5 min后，改變環(huán)轉(zhuǎn)方向?yàn)轫槙r針，按照上述方法再操作5 min。操作時發(fā)力應(yīng)平穩(wěn)著實(shí)，速度適中，每日治療1次，連續(xù)治療14 d。模型對照組：每日束縛于實(shí)驗(yàn)臺10 min，不予治療，只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測。每日束縛1次，連續(xù)捆綁14 d。正常對照組：同模型對照組。

表1 造模后各組大鼠戊巴比妥鈉睡眠實(shí)驗(yàn)比較（x±s）Tab.1 Comparison of sleep experiments on pentobarbital sodium in rats after moulding±s)min

表1 造模后各組大鼠戊巴比妥鈉睡眠實(shí)驗(yàn)比較（x±s）Tab.1 Comparison of sleep experiments on pentobarbital sodium in rats after moulding±s)min

注：與正常對照組相比，*P＜0．05。

組別 動物數(shù) 睡眠潛伏期 睡眠時間正常對照組 10 11．7±1．4 111．5±7．0模型對照組 10 25．2±1．5* 76．1±2．6*摩腹手法組 10 25．8±1．3* 76．9±2．6*

3.3 大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的水平 與正常對照組相比，模型對照組大鼠腦內(nèi)5-HT水平有明顯降低（P＜0．01），DA 和 NE 水平明顯升高（P＜0．01），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示動物模型造模成功。與模型對照組相比，摩腹手法組大鼠腦內(nèi)5-HT水平有顯著回升（P＜0．01），DA 和 NE 水平明顯回落（P＜0．01，P＜0．01），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示摩腹手法可通過調(diào)節(jié)大鼠腦內(nèi)DA、NE和5-HT這3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平，起到調(diào)節(jié)動物睡眠和覺醒狀態(tài)的作用。見表2。

2.4 檢測指標(biāo) 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）分別測定下丘腦樣品內(nèi)GABA、Orexin-A和腦干樣品內(nèi)DA、NE、5-HT的水平，按相應(yīng)試劑盒的說明操作。記錄所得的各組樣品的OD值，在配套軟件中，繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，計(jì)算相應(yīng)數(shù)據(jù)。

3.2 大鼠的一般情況 干預(yù)完成后，正常對照組大鼠精神最為良好，活動迅速，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)柔順光澤，體質(zhì)量有顯著增加；模型對照組大鼠精神明顯萎靡，毛發(fā)雜亂或豎直變硬且暗黃無光，或易受驚擾，消瘦；摩腹手法組大鼠精神、情緒及反應(yīng)情況均不如正常對照組，與模型對照組相比較平靜，偶見瞇眼，體質(zhì)量降低也相對較少。

表2 各組大鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平（x±s）Tab.2 Levels of monoamine neurotransmitters in the brains of rats of each group(±s)mg/mL

表2 各組大鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平（x±s）Tab.2 Levels of monoamine neurotransmitters in the brains of rats of each group(±s)mg/mL

注：與正常對照組比較，**P＜0．01；與模型對照組比較，##P＜0．01。

組別 動物數(shù) NE正常對照組 10 436．2±7．1模型對照組 10 474．6±8．1**摩腹手法組 10 451．3±4．7##DA 246．6±6．3 287．3±7．1**244．3±6．9##5-HT 254．4±10．3 213．5± 7．9**247．8± 7．5##

3.4 大鼠腦內(nèi)Orexin-A和GABA的水平 與正常對照組相比，模型對照組大鼠下丘腦Orexin-A水平有明顯升高（P＜0．01），GABA 水平明顯降低（P＜0．01），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示動物模型造模成功。與模型對照組相比，摩腹手法組大鼠下丘腦Orexin-A 水平有顯著回落（P＜0．05），但 GABA 水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05），提示摩腹手法可明顯降低大鼠下丘腦Orexin-A的水平，而對GABA水平并無明顯影響。見表3。

表3 各組大鼠腦內(nèi)Orexin-A和GABA的水平（x±s）Tab.3 Levels of Oresin-A and GABA of rats in each group(±s)mg/mL

表3 各組大鼠腦內(nèi)Orexin-A和GABA的水平（x±s）Tab.3 Levels of Oresin-A and GABA of rats in each group(±s)mg/mL

注：與正常對照組比較，**P＜0．01；與模型對照組比較，#P＜0．05。

組別 動物數(shù) Orexin-A GABA正常對照組 10 22．80±1．90 0．28±0．03模型對照組 10 31．90±1．81** 0．17±0．02**摩腹手法組 10 24．00±2．83# 0．19±0．02

4 討論

睡眠和覺醒的產(chǎn)生與維持主要依賴于腦內(nèi)的睡眠和覺醒系統(tǒng)[7]。下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)（VLPO）和內(nèi)側(cè)視前區(qū)的抑制性GABA能神經(jīng)元是腦內(nèi)主要的睡眠中樞，其釋放的抑制性遞質(zhì)GABA可在睡眠期抑制覺醒腦區(qū)的活動，促進(jìn)和維持睡眠。藍(lán)斑（LC）NE能、中縫背核（DR）5-HT能、黑質(zhì) DA能等單胺能神經(jīng)元，是腦內(nèi)覺醒調(diào)節(jié)中樞的主要結(jié)構(gòu)，其纖維末梢釋放相應(yīng)的覺醒遞質(zhì)，可直接調(diào)控對應(yīng)腦區(qū)的活動[8-9]，從而興奮皮質(zhì)和維持覺醒狀態(tài)。有研究表明VLPO睡眠中樞與單胺能覺醒中樞之間存在雙向的纖維聯(lián)系，并且是相互抑制的關(guān)系，這種關(guān)系是構(gòu)成人體睡眠和覺醒狀態(tài)穩(wěn)定的基礎(chǔ)。因此，上述神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化對機(jī)體睡眠和覺醒狀態(tài)的調(diào)節(jié)有著重要意義。這些結(jié)論在本實(shí)驗(yàn)中即得到體現(xiàn)：模型對照組大鼠腦內(nèi)的GABA、DA、NE和5-HT的水平與正常對照組相比均產(chǎn)生了顯著變化，并且，除了GABA水平外，摩腹手法組大鼠腦內(nèi)的DA、NE和5-HT的水平與模型對照組相比也都呈現(xiàn)出差異。據(jù)此推測：摩腹手法可能是對覺醒中樞的DA、NE和5-HT這3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響比較明顯，并以此降低了覺醒中樞對大腦皮質(zhì)的興奮作用；而對睡眠中樞及GABA的影響卻并不顯著。

工程地質(zhì)勘察是工程設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。地質(zhì)調(diào)查的質(zhì)量對工程的建設(shè)與設(shè)計(jì)有著重要的影響。必須加強(qiáng)工程地質(zhì)勘察的質(zhì)量管理。在目前的工程地質(zhì)勘察質(zhì)量管理中，仍然存在一些影響地質(zhì)勘察質(zhì)量管理的問題。

當(dāng)今世界，知識經(jīng)濟(jì)深入發(fā)展、創(chuàng)新發(fā)展加快推進(jìn)。在我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展新常態(tài)下，知識產(chǎn)權(quán)制度已經(jīng)成為激勵創(chuàng)新的基本保障，知識產(chǎn)權(quán)已經(jīng)成為發(fā)展的重要資源和競爭力的核心要素。具體而言，《知識產(chǎn)權(quán)基本法》的立法背景包括以下三個方面。

此外，下丘腦后外側(cè)區(qū)的Orexin能系統(tǒng)被認(rèn)為是機(jī)體的“覺醒開關(guān)”[10]，它與上述睡眠和覺醒調(diào)節(jié)系統(tǒng)都分別存在雙向的神經(jīng)元投射關(guān)系，并通過Orexin（A和B）的分泌影響其活動，是上述睡眠和覺醒調(diào)節(jié)系統(tǒng)的最終調(diào)控系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)Orexin神經(jīng)元可通過多種途徑影響GABA、DA、NE和5-HT的水平[11-17]。本實(shí)驗(yàn)中，模型對照組大鼠腦內(nèi)Orexin-A水平較正常對照組有明顯升高，而摩腹手法組大鼠下丘腦Orexin-A水平較模型對照組有顯著回落?？梢?，無論是睡眠剝奪造模還是摩腹手法干預(yù)，都對大鼠下丘腦Orexin-A的水平造成了明顯影響，而下丘腦Orexin-A水平的變化也明顯反映了大鼠睡眠與覺醒的狀態(tài)，這也從側(cè)面印證了上述研究結(jié)論。但是，有關(guān)下丘腦Orexin-A對GABA、DA、NE和5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)的影響在本實(shí)驗(yàn)中未能涉及，希望可以在今后得到進(jìn)一步研究。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為失眠屬于“不寐”的范疇，而推拿療法中的腹部推拿療法，能夠很好的針對“不寐”的病因病機(jī)，對機(jī)體直接產(chǎn)生作用。《難經(jīng)》曰：“人之安臥，神歸心，魄歸肺，魂歸肝，意歸脾，志歸腎，五臟各安其位而寢?！薄鹅`樞·淫邪發(fā)夢》指出：“正邪從外襲內(nèi)，而未有定舍，反淫于臟……使人臥不得安而喜夢?！笨梢?，失眠與腹部五臟功能的穩(wěn)定有著密切關(guān)系。而本實(shí)驗(yàn)中使用的摩腹手法可直接作用于腹部，手法作用范圍涵蓋了腹部的脾、胃、肝、腎經(jīng)以及任脈、沖脈和帶脈，依據(jù)中醫(yī)經(jīng)絡(luò)臟腑學(xué)說，通過對腹部相應(yīng)經(jīng)絡(luò)腧穴進(jìn)行推按與摩運(yùn)，能起到貫通身體上下氣機(jī)，調(diào)節(jié)五臟六腑機(jī)能的作用。手法作用于任脈、沖脈和帶脈，可起到一定的調(diào)沖任以調(diào)周身氣血，強(qiáng)帶脈以強(qiáng)諸經(jīng)溝通的作用，手法作用于脾、胃、肝、腎經(jīng)以及腹內(nèi)肝、胃、脾、小腸等臟腑，亦可在一定程度上起到柔肝、和胃、實(shí)脾的作用[18]，最終來改善“不寐”的癥狀。