“醒腦開竅”針刺法對(duì)腦缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)元KATP通道細(xì)胞電生理的調(diào)控研究*

韓 林 ，高 旸 ，王旭慧 ，張亞男 ，王 舒

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸部，天津 300193；2．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸研究所，天津 300193）

腦缺血后一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血流，組織損傷和功能障礙反而加重，甚至導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)性損傷，被稱為腦缺血再灌注損傷，腦缺血再灌注損傷是多種腦血管疾病的誘因，其發(fā)生機(jī)制目前尚未完全闡明[1]。針刺對(duì)抗腦缺血再灌注損傷療效肯定。針刺基于傳統(tǒng)經(jīng)絡(luò)學(xué)說，以多重作用、多靶點(diǎn)的方式發(fā)揮遍及全身的整體治療效應(yīng)。這些效應(yīng)作為一種典型的生物信息傳遞包含各種細(xì)胞電生理及生物化學(xué)改變。研究發(fā)現(xiàn)，三磷酸腺苷敏感性鉀通道（KATP）可能作為重要的作用靶點(diǎn)參與了腦缺血再灌注損傷的病理過程[2-3]。在腦組織低氧或缺血性損傷時(shí)，KATP通道開放可使神經(jīng)元興奮性降低，減少神經(jīng)元的損傷和蛻變[4]。但針刺是否通過調(diào)節(jié)KATP通道對(duì)抗腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制目前尚不明確。本研究將采用膜片鉗技術(shù)觀測(cè)“醒腦開竅”針刺法對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠（MCAO/R）海馬神經(jīng)元KATP通道電生理特性的影響，從離子通道角度探討針刺對(duì)抗腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性Wistar大鼠（SPF級(jí)）32只，體質(zhì)量150～200 g，周齡4～6周。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（京）2016-0011。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、假手術(shù)組、模型組、電針組，每組8只大鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于二級(jí)動(dòng)物房喂養(yǎng)，室溫（20～25℃），光照時(shí)間（07：00～19：00）自由攝食、飲水。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵循中華人民共和國科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 主要試劑及溶液 鏈霉蛋白酶XIV（批號(hào)：SLBJ2160V）、格列苯脲（批號(hào)：075K1376）、羥乙基磺酸鈉（批號(hào)：MKBH0413V）均購自美國Sigma公司。主要溶液：1）高滲透蔗糖溶液（HSS）（mmol/L）：Sucrose 234，KCl 2．5，Na2HPO41，CaCl20．1，HEPES 15，GLUCOSE 11，MgSO44（pH7．3 with NaOH）。2）羥乙基磺酸鈉溶液（HSSB）（mmol/L）：羥乙基磺酸鈉132，KCl 2，CaCl20．1，MgCl24，HEPES 15，GLUCOSE 23（pH7．3 with NaOH）。3）Earle's平衡的鹽溶液（EBSS）（mmol/L）：NaHCO326，CaCl21．8，MgSO40．8，KCl 5．35，NaCl 116，NaH2PO41，GLUCOSE 5．56，酚紅 0．003（pH7．3 with NaOH）。4）Hanks平衡鹽溶液（HBSS）（mmol/L）：KCl 5．37，KH2PO40．441，NaCl 137，Na2HPO40．34，HEPES 11，酚紅 0．003，MgCl24，GLUCOSE 5．56，CaCl21（pH7．3 with NaOH）。5）細(xì)胞浴液（mmol/L）：KCl 140，HEPES 10，EGTA 2（pH7．3 with KOH）。6）微電極內(nèi)液：KCl 140，CaCl21，MgCl20．5，HEPES 10（pH7．3 with KOH）。以上試劑均采用國產(chǎn)優(yōu)質(zhì)分析純，以去離子水配制而成。

1.3 儀器設(shè)備 膜片鉗放大器（HEKA EPC-10德國），數(shù)據(jù)采集軟件 Patchmaster（HEKA，德國），數(shù)據(jù)分析軟件 Fitmaster（HEKA，德國），程控玻璃微電極拉制儀（P-97型，美國），振動(dòng)切片機(jī)（World Precision Instruments MA752-04，美國），微電極操縱器（MP-285/R，美國），倒置顯微鏡（Nikon Ti-S，日本），韓氏神經(jīng)穴位刺激儀HANS-200E購自南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司。

1.4 模型制作 模型組、電針組每組各8只大鼠參照ZeaLonga線栓法并加以改進(jìn)[5]，制作大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉（3 mL/kg）。頸部手術(shù)區(qū)域備皮、消毒，取頸部正中稍偏左切口1．5～2 cm，分離皮下筋膜，暴露左側(cè)胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌間的三角區(qū)，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈分叉處遠(yuǎn)心端和近心端分別用動(dòng)脈夾夾閉，用1 mL注射器針頭在近心端血管壁穿刺，將直徑0．26 mm的尼龍線栓沿針孔緩慢插入（線栓尖端經(jīng)細(xì)砂紙打磨圓頓、光滑），待線栓前段抵達(dá)分叉處，放開此處動(dòng)脈夾，將線栓繼續(xù)送入頸內(nèi)動(dòng)脈，直至微遇阻力為止，線栓進(jìn)入顱內(nèi)深度為18～20 mm，插線成功后結(jié)扎頸總動(dòng)脈，放開另一個(gè)動(dòng)脈夾，分層縫合。假手術(shù)組僅分離頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，不插入尼龍線栓。按Zausinger六分法[6]對(duì)神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分為0～5分，評(píng)分越低，神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。排除評(píng)分為0、4、5分及死亡動(dòng)物，選擇評(píng)分為1、2、3分的大鼠進(jìn)入下一階段實(shí)驗(yàn)。

1.5 針刺選穴及干預(yù)方法 電針組8只大鼠于造模成功后針刺內(nèi)關(guān)、水溝、三陰交；空白組、假手術(shù)組、模型組大鼠同樣抓取，但不給予針刺治療。根據(jù)中國針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的“動(dòng)物針灸穴位圖譜”，并參考大鼠的解剖結(jié)構(gòu)和體表標(biāo)志，水溝位于鼻尖下1 mm唇裂正中，內(nèi)關(guān)位于前肢內(nèi)側(cè)，腕關(guān)節(jié)上約3 mm，尺、橈骨間隙中；三陰交位于后肢內(nèi)踝尖直上1 cm。針具選用蘇州醫(yī)療用品廠生產(chǎn)的“華佗牌”毫針，長40 mm，直徑0．30 mm。電針儀選用韓氏神經(jīng)穴位刺激儀HANS-200E（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為YZB/蘇0049-2008）。先直刺雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴1 mm至筋間，繼在鼻中隔下部向上45°斜刺人中穴1 mm，其次直刺患側(cè)三陰交穴3 mm，留針20 min；留針期間將患側(cè)內(nèi)關(guān)穴、三陰交穴針柄分別連接至韓氏神經(jīng)穴位刺激儀，施以疏密波，頻率2 Hz/15 Hz，電流1 mA。首次針刺在動(dòng)物造模成功90 min后進(jìn)行，每天針刺2次，每天10時(shí)、16時(shí)各針刺1次，共3 d。

1.6 海馬神經(jīng)元的急性分離 治療結(jié)束后次日，各組大鼠以水合氯醛腹腔麻醉（3 mL/kg）后快速斷頭取腦，在0～4℃通以100%O2的HSS中冰凍2 min后用震動(dòng)切片機(jī)將腦組織切成400 μm厚度的薄片；用HSSB漂洗腦片3次，在33℃通有95%O2和5%CO2混合氣體的Earle's平衡鹽溶液EBSS中孵育1．5 h；將腦片轉(zhuǎn)移到HSSB中，于解剖顯微鏡視野下剝離海馬組織CA1區(qū)，放入盛有鏈霉蛋白酶（Protease XIV 1．3 g/L）的Hanks平衡鹽溶液的容器中，通入100%O2，在33℃酶溶液中酶解30 min；將組織在HSSB溶液中漂洗3次，用Pasteur吸管按口徑由大到小的順序吹打，使組織分散（吸管尖端口徑分別為500、300、150 μm）；靜置后將中層液體滴入表面潔凈的蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁后用正常浴液漂洗2次；加入2 mL細(xì)胞浴液，選取有明顯突起、邊界清楚、胞質(zhì)均勻一致的錐體神經(jīng)元進(jìn)行記錄[7]。

1.7 單通道膜片鉗 記錄用P-97水平微電極拉制儀，采用兩步拉制法將硬質(zhì)厚壁玻璃電極毛坯拉制成封接電極。電極尖端直徑0．5～1 μm。沖灌電極液以不超過電極長度的1/3為宜。充灌電極液后，電極入水電阻大約在5～8 MΩ之間。將記錄浴槽置于倒置顯微鏡下，以（400×）的放大倍數(shù)觀察細(xì)胞，選擇胞膜清晰、胞體透亮、胞質(zhì)均勻，貼附良好的錐體細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。由膜片鉗放大器在±60 mV范圍內(nèi)以20 mV為階躍輸出鉗制電壓，觀察通道電流活動(dòng)。采樣時(shí)間為10 s，采樣間隔為5 s。玻璃微電極內(nèi)插氯化銀電極與膜片鉗放大器（HEKA EPC-10德國）相連，放大器探頭反饋電阻為50 GΩ，低通濾波器濾波頻率為3 kHz。單通道電流以Patchmaster數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)（HEKA，德國）采集入計(jì)算機(jī)，測(cè)量結(jié)果用Fitmaster軟件進(jìn)行信號(hào)分析處理。采樣頻率為5 kHz，測(cè)量通道開關(guān)事件的時(shí)間分辨率為300 μs。

單通道事件的檢測(cè)采用50%閾值法，電流幅度通過對(duì)電流幅度直方圖進(jìn)行Gaussian擬合獲得；平均開放時(shí)間通過對(duì)對(duì)數(shù)平方根直方圖采用Exponential log probabilitiy擬合獲得；開放概率以NPo表示，NPo是指在某一指令電壓條件下，鉗制膜片上所有通道總的開放概率，NPo=t0/t其中N：膜片上通道的數(shù)目；Po：指令電壓條件下，刺激時(shí)間內(nèi)，正在開放的單個(gè)通道的開放概率；t0：每個(gè)sweep期間，單個(gè)通道的開放時(shí)間；t：指令電壓下，刺激持續(xù)總的時(shí)間。主要檢測(cè)指標(biāo)：1）神經(jīng)元形態(tài)觀測(cè)。2）+60 mV鉗制電壓下KATP通道電流幅度，開放時(shí)間，開放概率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 21．0系統(tǒng)軟件，正態(tài)分布計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著差值法（LSD法），P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 與本組治療前比較，電針組治療后神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高（P＜0．01）；與空白組、假手術(shù)組比較，模型組治療前、治療后神經(jīng)功能評(píng)分均明顯降低（P＜0．01）；與模型組比較，電針組治療后神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高（P＜0．01）。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（x±s）Tab.1 Comparison of neurological deficits scores of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（x±s）Tab.1 Comparison of neurological deficits scores of rats in each group（±s）

注：與治療前比較，**P＜0．01，與模型組比較，##P＜0．01。

組別 動(dòng)物數(shù) 治療前 治療后空白組 8 5．00±0．00## 5．00±0．00##假手術(shù)組 8 5．00±0．00## 5．00±0．00##模型組 8 2．25±0．46 2．25±0．71電針組 8 2．13±0．35 3．38±0．74**##

2.2 神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下對(duì)各組海馬組織急性分離所獲得的神經(jīng)元進(jìn)行觀測(cè)，并選擇形態(tài)完整，活性良好的神經(jīng)元進(jìn)行膜片鉗記錄。健康的神經(jīng)元：胞體具有統(tǒng)一的亮視野，形狀為椎體或梭形，無暗斑，近端樹突結(jié)構(gòu)保留，頂端日暈結(jié)構(gòu)完整；死亡的神經(jīng)元胞體為統(tǒng)一的暗視野，胞體充滿暗斑。不健康神經(jīng)元胞體布有水泡，樹突呈串珠樣改變，胞膜模糊，胞體腫脹，胞漿有明顯的黑色顆粒。（圖 1，A-D）。

圖1 各組大鼠神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphological observation of neurons in each group

2.3 KATP通道電生理特性 在對(duì)稱性高鉀浴液中（細(xì)胞浴液與電極內(nèi)液K+濃度均為140 mmol/L），所記錄的KATP通道開放多呈簇狀和猝發(fā)樣，兩次開放之間常為較長時(shí)間的關(guān)閉狀態(tài)。KATP通道電流的幅度隨超極化或去極化程度加大而增大（圖2A），在同一鉗制電位下，通道電流幅度基本相同，呈波寬不等的矩形方波。細(xì)胞浴液內(nèi)加入KATP通道特異性阻斷劑格列苯脲（Glybenclamide 0．1mmol/L）可基本阻斷KATP通道的開放（圖2B）。由電流-電壓關(guān)系曲線（I-V曲線）的斜率得出所記錄的單通道電導(dǎo)為80．1±7．6 pS（膜片數(shù) n=8）（圖 2C）。

2.4 電針對(duì)各組大鼠海馬神經(jīng)元KATP通道的影響 由于+60 mV鉗制電壓下所記錄的電流曲線基線平穩(wěn)，噪音相對(duì)較少，通道開放穩(wěn)定，故實(shí)驗(yàn)對(duì)+60mV鉗制電壓下所記錄到的電流曲線進(jìn)行擬合分析，各組隨機(jī)選取8個(gè)封接成功的膜片進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。與正常組比較，假手術(shù)組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元KATP通道電流幅度、開放時(shí)間、開放概率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均 P＞0．05）；與正常組、假手術(shù)組比較，模型組開放時(shí)間、開放概率均明顯增大（P＜0．01），電流幅度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）；與模型組比較，電針組開放時(shí)間、開放概率明顯減?。≒＜0．01），電流幅度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。見表 2。

3 討論

圖2 KATP通道電生理特征Fig.2 Electrophysiological characteristics of KATPchannels

表2 +60 mV鉗制電壓下各組電流幅度、開放時(shí)間及開放概率比較（±s）Tab.2 Comparisonofcurrentamplitude，opentimeandopen probability under the holding potential of+60 mV(x±s)

表2 +60 mV鉗制電壓下各組電流幅度、開放時(shí)間及開放概率比較（±s）Tab.2 Comparisonofcurrentamplitude，opentimeandopen probability under the holding potential of+60 mV(x±s)

注：與模型組比較，*P＜0．01。

組別 膜片數(shù) 電流幅度（mV） 開放時(shí)間（ms） 開放概率正常組 8 5．02±2．41 1．45±0．51* 0．09±0．06*假手術(shù)組 8 6．33±1．31 1．65±0．56* 0．07±0．06*模型組 8 5．00±3．25 4．56±1．14 0．33±0．14電針組 8 6．27±0．93 1．51±0．95* 0．06±0．05*

“醒腦開竅”針刺法是石學(xué)敏院士創(chuàng)立的治療中風(fēng)病行之有效的方法。多年來“醒腦開竅”針刺法廣泛應(yīng)用于缺血性腦卒中的臨床治療，效果顯著。內(nèi)關(guān)、水溝、三陰交為“醒腦開竅”針刺法主穴。內(nèi)關(guān)為八脈交會(huì)穴，通陰維脈，為手厥陰心包經(jīng)之絡(luò)穴，有寧心安神、疏通氣血之功；水溝為督脈與手、足陽明經(jīng)之會(huì)穴，督脈起于胞中，上行入腦達(dá)巔，故針刺水溝可調(diào)督脈、開竅啟閉以醒腦安神；三陰交穴為肝、脾、腎三陰經(jīng)的交會(huì)穴，能激發(fā)三陰氣血，達(dá)到養(yǎng)血安神之功。近年來，“醒腦開竅”針刺法干預(yù)腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究從細(xì)胞、亞細(xì)胞水平逐步深入到分子水平，其防治腦損傷的作用機(jī)制主要體現(xiàn)在改善神經(jīng)缺損、提高細(xì)胞缺血后抗氧化能力、抑制缺血-再灌注損傷、改善腦供血等方面[8]。

ATP敏感性鉀通道是電壓非依賴性配體門控通道，由內(nèi)向整流鉀通道和硫脲類受體（SUR）組成，是一組直接將細(xì)胞能量代謝和電活動(dòng)相耦聯(lián)的重要通道，該通道廣泛分布于大腦各類神經(jīng)元中，參與多種細(xì)胞功能調(diào)控。KATP通道開放使得K+外流，細(xì)胞膜超極化，細(xì)胞興奮性降低，這種超極化可以使細(xì)胞膜電位更接近于K+平衡電位。在腦缺血再灌注損傷中，KATP通道的開放可以穩(wěn)定膜電位，避免神經(jīng)元受到去極化和興奮性毒性造成的損傷[9]。KATP通道產(chǎn)生的內(nèi)向整流鉀電流可以被細(xì)胞內(nèi)ATP所抑制，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP/ADP比率升高，可使KATP通道關(guān)閉，引起細(xì)胞的去極化，而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP/ADP比率降低，可使KATP通道開放，引起細(xì)胞的超極化[10]。在生理?xiàng)l件下，由于腦組織細(xì)胞內(nèi)ATP含量處于高水平，神經(jīng)元KATP通道處于關(guān)閉狀態(tài)，而在缺氧缺血、缺血預(yù)適應(yīng)或代謝抑制的病理?xiàng)l件下由于細(xì)胞內(nèi)ATP/ADP比率降低，KATP通道則開放，通過使神經(jīng)元膜電位超極化、降低神經(jīng)元興奮性等途徑減少神經(jīng)元損傷和退變[11]。

針刺抗腦組織缺氧缺血損傷作用已得到確證，它的作用可能與調(diào)節(jié)KATP通道開放相關(guān)。我們課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)針刺可能通過KATP通道調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路，從而減少腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]。Jiang等[13]以電針預(yù)處理新生缺氧缺血大鼠，發(fā)現(xiàn)電針可促進(jìn)KATP通道開放，抑制電壓依賴性鈣通道開放，減輕Ca2+超載和減少興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，降低核轉(zhuǎn)錄因子c-fos和c-jun蛋白的表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生。許靜等[14]以電針百會(huì)、大椎穴干預(yù)MCAO大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)針刺能使線粒體mito-KATP通道開放，減少線粒體內(nèi)鈣釋放、維持缺血缺氧后線粒體的穩(wěn)定性；減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而保護(hù)神經(jīng)元。

目前從細(xì)胞電生理角度探討針刺對(duì)抗腦缺血作用機(jī)制的研究非常少見，這與神經(jīng)元個(gè)體微小，很難在離體環(huán)境中存活有關(guān)。膜片鉗技術(shù)是在電壓鉗的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種記錄細(xì)胞膜離子通道電生理活動(dòng)的技術(shù)。發(fā)展至今，已成為現(xiàn)代細(xì)胞電生理研究的先進(jìn)方法，為解決生物信息的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)問題提供了先進(jìn)的研究手段。膜片鉗技術(shù)可直接觀測(cè)到細(xì)胞膜離子通道的電學(xué)改變用以解釋針刺的細(xì)胞作用機(jī)制[15]。本項(xiàng)研究借助單細(xì)胞膜片鉗技術(shù)直接觀測(cè)“醒腦開竅”針刺法對(duì)MCAO/R大鼠海馬神經(jīng)元KATP通道電生理特性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：腦缺血再灌注后大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯下降，說明大鼠神經(jīng)功能明顯受到損傷，而海馬椎體神經(jīng)元KATP通道開放時(shí)間明顯延長、開放概率明顯增大，說明腦缺血再灌注損傷后海馬組織KATP通道開放活動(dòng)明顯增加，腦組織通過調(diào)節(jié)KATP通道開放維持細(xì)胞能量代謝，降低神經(jīng)元興奮性而發(fā)揮自我保護(hù)效應(yīng)，這一發(fā)現(xiàn)與之前文獻(xiàn)報(bào)道相一致[16-17]。而電針“醒腦開竅”針刺法主穴后大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高，說明神經(jīng)功能得到改善，而海馬神經(jīng)元KATP通道開放時(shí)間、開放概率明顯降低，說明針刺有效的對(duì)抗了腦缺血再灌注損傷，起到維持神經(jīng)元正常能量代謝的作用，使海馬神經(jīng)元KATP通道開放活動(dòng)趨于正常水平。另外，我們發(fā)現(xiàn)模型組、電針組海馬神經(jīng)元KATP通道電流幅度較空白組、假手術(shù)組均無明顯差異，說明腦缺血再灌注損傷及針刺干預(yù)均未對(duì)KATP通道電流幅度產(chǎn)生影響。目前，本研究僅涉及造模后針刺的后處理效應(yīng)，對(duì)于針刺的預(yù)處理是否可在腦缺血再灌注的病理過程中進(jìn)一步激活KATP通道開放，以及隨著腦缺血再灌注病理損傷的出現(xiàn)，KATP通道開放的動(dòng)態(tài)變化等問題將成為下一步研究關(guān)注的重點(diǎn)。