大孔吸附樹脂純化左金丸總生物堿工藝研究

龔來覲，李鶴，楊芳

(江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院 中醫(yī)藥學(xué)院，江西 樟樹 331200)

左金丸出自《丹溪心法》，為朱丹溪名方之一。該方由黃連、吳茱萸按6：1的劑量組成，具有清瀉肝火、降逆止嘔之效?，F(xiàn)代藥理研究其有多方面作用，而抗?jié)優(yōu)樽钪饕乃幚碜饔弥籟1]。具有抗?jié)兯幚碜饔玫闹饕钚晕镔|(zhì)為生物堿類化合物，因此,此類化合物含量的高低直接決定了臨床療效。我們通過研究發(fā)現(xiàn)，不同溶劑提取的左金丸活性部位對(duì)大鼠胃潰瘍均有不同程度的抑制作用，其中鹽酸-乙醇(1∶100)組對(duì)胃潰瘍的抑制率最高[2]，但其活性部位的純化工藝研究尚未見報(bào)道。本文以鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的吸附率及解吸率為指標(biāo)，篩選了大孔樹脂型號(hào)及純化工藝參數(shù)，并采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最佳工藝條件，為左金丸抗?jié)兓钚圆课坏闹苽涮峁┝藢?shí)驗(yàn)依據(jù)，為進(jìn)一步研發(fā)抗?jié)冃滤幪峁┝死碚摶A(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀(Agilent1260液相色譜)；C18ODS-Box柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；UV-3300紫外-可見分光光度計(jì)、石英比色皿(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；BS-124S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；小型粉碎機(jī)(北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限)；RE 5298A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

鹽酸小檗堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為110713-201708、110802-201709、110801-201709、110733-201609、110732-201611)；黃連與吳茱萸均購(gòu)于樟樹藥材交流中心，經(jīng)學(xué)院龔福保教授鑒定，黃連為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.的干燥根莖，吳茱萸為蕓香科植物Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.的干燥近成熟的果實(shí)；大孔吸附樹脂NKA-9、D101、AB-8、DM-301、HPD-100樹脂(天津市海光化工有限公司)；甲醇(色譜純，美國(guó)默克公司)；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取左金丸粗粉28 g(黃連∶吳茱萸6∶1)，置于500 mL錐形瓶中，加鹽酸-乙醇(1∶100)300 mL靜置30 min，超聲提取40 min，提取過程中溶劑揮發(fā)可再加入適量鹽酸-乙醇(1∶100)，冷卻，抽濾，濾液45℃下減壓濃縮至近干，加入適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加甲醇定容即得樣品液(生藥量0.28 g·mL-1)；精密吸取樣品液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，0.45 μm微孔濾膜濾過， 即得供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿適量，分別加甲醇溶解，制成每1 mL中含鹽酸小檗堿8.6 mg,鹽酸巴馬汀8.1 mg,鹽酸藥根堿10.6 mg,吳茱萸堿1.25 mg,吳茱萸次堿1.5 mg的對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液。

2.3 色譜條件

色譜柱ODS-Box(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-25 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液(B，pH 4.5)，梯度洗脫(0～35 min，10%～45%A；35～65 min，45%～60%A)；柱溫：25℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL[3-4]。

2.4 樹脂的預(yù)處理

分別取NKA-9、D101、AB-8、DM-301、HPD-1005種型號(hào)大孔樹脂置于層析柱中，加入高于樹脂層10 cm的95%乙醇浸泡24 h充分溶脹后，再用95%乙醇洗，至流出液加蒸餾水不渾濁為止，最后用蒸餾水洗至水液澄清無醇味，備用[5-6]。

2.5 樹脂型號(hào)的選擇

2.5.1 靜態(tài)吸附的考察

預(yù)處理好的5種型號(hào)大孔吸附樹脂各取3份，每份準(zhǔn)確稱2.0 g后分別放于15個(gè)250 mL錐形瓶中，各加入20 mL樣品液(生藥量為0.28 g·mL-1)，磁力攪拌20 min，靜置過夜(約12 h)，使樹脂吸附藥液至飽和，過濾，適量蒸餾水沖洗樹脂，合并濾液，水浴蒸干。殘?jiān)蛹状?0 mL超聲溶解20 min，過濾，濾液揮干，甲醇溶解并定容至5 mL，過濾，通過測(cè)定鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量計(jì)算吸附率，結(jié)果見表1。其中綜合評(píng)分為5種成分平均吸附率之和除以5。吸附率的計(jì)算公式如下：

吸附率(%)=(C0-Ce)/C0×100%

C0上樣液質(zhì)量濃度，Ce為吸附平衡后濾液質(zhì)量濃度。

表1 5種大孔樹脂靜態(tài)吸附5種成分平均吸附率(%,n=3)

由表1可知，5種樹脂中綜合評(píng)分最高依次為AB-8>D-101>NKA-9>HPD-100>DM-301，其中AB-8對(duì)5種成分的平均吸附率為77.83%，D-101平均吸附率為70.42%。沒有明顯差異，故對(duì)AB-8和D-101進(jìn)行動(dòng)態(tài)考察[7]。

2.5.2 動(dòng)態(tài)吸附的考察

將預(yù)處理好的AB-8和D-101兩種樹脂各5 mL分別裝入2根同樣規(guī)格的層析柱中，再各取20 mL樣品液(生藥量為0.28 g·mL-1)分別上樣，以0.1倍柱體積·min-1流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，然后水洗脫至流出液Molish反應(yīng)陰性，再依次用30%，50%，70%，95%的乙醇各30 mL洗脫，分別收集各部分洗脫液，減壓濃縮干，殘?jiān)眉状?5 mL超聲溶解20 min，過濾掉不溶物，濾液揮干后甲醇溶解定容至5mL，過濾，通過測(cè)定5種成分含量計(jì)算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表2。其中綜合評(píng)分為5種成分轉(zhuǎn)移率之和除以5。轉(zhuǎn)移率的計(jì)算公式如下：

轉(zhuǎn)移率=洗脫量/上樣量×100%

表2 2種大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附5種成分轉(zhuǎn)移率及綜合評(píng)分(%)

由表2可知，AB-8的綜合轉(zhuǎn)移率為83.65%，D-101的綜合轉(zhuǎn)移率為58.41%，AB-8明顯優(yōu)于D-101，故選用AB-8型大孔樹脂對(duì)左金丸藥液進(jìn)行進(jìn)一步工藝參數(shù)的優(yōu)化。

2.6 AB-8型大孔樹脂分離富集條件優(yōu)化

2.6.1 正交試驗(yàn)對(duì)工藝參數(shù)的優(yōu)化

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)上樣藥液濃度(A)、上樣流速(B)、樹脂的徑高比(C)、洗脫劑濃度(D)對(duì)成分的洗脫率有較大影響，因此選上述4個(gè)因素為考察因素，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表(見表3)。分別收集各組條件洗脫液，選擇5種成分洗脫率考察，平行實(shí)驗(yàn)3次，3次的平均值見表4。綜合評(píng)分為5種成分洗脫率的平均值，對(duì)每組數(shù)據(jù)綜合評(píng)分的方差分析見表5，各因素水平綜合評(píng)分的K值見表6。

表3 AB-8型大孔樹脂優(yōu)化工藝正交試驗(yàn)因素水平表

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果各組洗脫率平均值(%,n=3)

表5 方差分析表

F0.01(2,2)=99，F(xiàn)0.05(2,2)=19

表6 AB-8型大孔樹脂優(yōu)化工藝正交試驗(yàn)洗脫率綜合評(píng)分K值

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，因素A(上樣藥液濃度)，B(上樣流速)，C(徑高比)，D(乙醇濃度)具有顯著性差異，最佳工藝為上樣藥液濃度0.14 g/mL,上樣流速9 BV/h，徑高比1∶10，70%乙醇洗脫。

2.6.2 泄露曲線

量取預(yù)處理好的AB-8大孔吸附樹脂20 mL裝入層析柱(徑高比約1∶10)，再將稀釋一倍的樣品液(生藥量為0.14 g/mL)上樣，上樣流速為9BV/h。每試管收集5 mL流出液，共收集20試管。測(cè)定每試管中鹽酸小檗堿、吳茱萸堿含量，以每試管中鹽酸小檗堿、吳茱萸堿質(zhì)量為縱坐標(biāo)，累計(jì)上樣體積為橫坐標(biāo)，繪制泄露曲線，見圖1。由圖1可知，上樣60 mL后鹽酸小檗堿、吳茱萸堿開始明顯泄露，因此上樣量最多8.4 g，即最佳上樣量與樹脂體積比為1∶2.4。

圖1 泄漏曲線

2.6.3 洗脫劑用量的考察

將0.14 g/mL樣品溶液按上樣量與樹脂體積比1∶2.4上柱(徑高比約1∶10，濕樹脂體積10 mL)，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附3 h，然后用2 BV水洗脫將雜質(zhì)去除，再用70%乙醇將成分洗脫，收集乙醇洗脫液，前2試管每試管收集10mL，以后每試管收集5 mL，共收集15試管，測(cè)定每試管中鹽酸小檗堿、吳茱萸堿含量。以每試管中鹽酸小檗堿、吳茱萸堿質(zhì)量為縱坐標(biāo)，累計(jì)洗脫體積為橫坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，見圖2。由圖2可知當(dāng)洗脫溶劑為70 mL時(shí)，可同時(shí)將鹽酸小檗堿、吳茱萸堿洗脫完全，即洗脫劑用量為7 BV。

圖2 洗脫曲線

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

按優(yōu)選的最佳純化工藝，即以質(zhì)量濃度為0.14 g/mL(相當(dāng)于原生藥)，上樣量為2.4倍樹脂體積的左金丸乙醇提取液上樹脂柱(徑高比1∶10)后，先以2BV蒸餾水除去雜質(zhì)，再用7 BV體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗脫，以9 BV/h流速收集體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗脫部分。以HPLC法測(cè)定各成分的吸附-洗脫轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表7。

表7 工藝驗(yàn)證5種成分吸附率、洗脫率、轉(zhuǎn)移率

由表7可知，左金丸中5種成分精制后含量保留均在75%以上，其中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿3種成分保留85%以上，說明采用大孔樹脂對(duì)左金丸鹽酸-乙醇(1∶100)提取液進(jìn)行精制是合理可行的。

3 討論

有文獻(xiàn)報(bào)道[8-10]左金丸可以通過調(diào)節(jié)胃酸分泌及促進(jìn)胃黏膜愈合等作用來達(dá)到抗胃潰瘍的效果，黃連在方中發(fā)揮最主要的藥效，其中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿3種成分水溶性強(qiáng)，容易吸收入血，本課題前期研究還發(fā)現(xiàn)吳茱萸中的吳茱萸堿、吳茱萸次堿2種成分對(duì)幽門螺旋桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，因此將以上5種成分作為優(yōu)選左金丸精制工藝的檢測(cè)指標(biāo)。

雖然左金丸只由兩味藥組成，其抗?jié)冇行С煞种饕獮樯飰A類化合物，但提取液中仍有多糖、蛋白質(zhì)、鞣制等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)用一般的純化方法不易分離完全，且主要成分損失較大，因此選擇一種純化效果好的大孔樹脂十分必要。從鹽酸小檗堿、吳茱萸堿等的化學(xué)結(jié)構(gòu)看都含有2～3個(gè)苯環(huán)，吳茱萸堿、吳茱萸次堿的極性較小，疏水性強(qiáng)，而鹽酸小檗堿有一定的親水性，因此將這5種有一定極性差異的化合物完全吸附洗脫有一定難度。AB-8型大孔吸附樹脂為聚苯乙烯型弱極性吸附樹脂，對(duì)環(huán)狀芳香族化合物有很強(qiáng)的吸附能力，特別隨被吸附分子親油性增加而增強(qiáng)，這可能是對(duì)吳茱萸堿吸附好的原因。由于AB-8型樹脂表面有一定的酯基，其親水性有一定改善，這可能是對(duì)鹽酸小檗堿這類化合物也能有較好吸附的原因。

經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后，所得干浸膏中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿5種成分的轉(zhuǎn)移率分別為89.06%，87.23%、85.35%、79.72%、78.47%，所得干浸膏顏色為黃色至黃褐色，干燥后不易吸濕，由此可見糖類、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等雜質(zhì)去除較徹底，純化后主要5種生物堿的含量都有很大提高，為左金丸抗?jié)兓钚圆课豢偵飰A提取物的制備工藝提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為進(jìn)一步左金丸抗?jié)兯幮镔|(zhì)基礎(chǔ)研究，譜效關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。