三陽清解液乙狀結(jié)腸滴注對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱模型解熱機(jī)制的研究

湯瑞蓮，王曉燕

(鄭州市中醫(yī)院，河南 鄭州 450007)

小兒外感發(fā)熱是兒科常見病、多發(fā)病，屬中醫(yī)“感冒”范疇，小兒患病“傳變迅速”，易入里化熱，小兒“脾常不足”，感邪之后易乳食停滯，故小兒感冒以風(fēng)熱夾滯證多見，而小兒臟腑薄、藩籬疏，易于傳變，往往太陽表證未解而病邪即入少陽半表半里，正邪交爭，引動(dòng)膽經(jīng)郁熱，上迫心神，橫逆犯胃，而致小兒就診時(shí)大多太陽、少陽、陽明三陽癥并見。三陽清解液是河南省首屆名中醫(yī)王曉燕教授用于治療小兒外感發(fā)熱(風(fēng)熱夾滯型)的臨床效驗(yàn)方，依據(jù)張仲景六經(jīng)辨證理論，在柴葛解肌湯、大柴胡湯、白虎湯基礎(chǔ)上衍化而來，臨床使用二十余年，療效確切[1-2]、不良反應(yīng)小。本研究通過觀察三陽清解液乙狀結(jié)腸滴注對(duì)LPS誘導(dǎo)發(fā)熱模型大鼠下丘腦cAMP、PGE2含量和血清IL-1β、TNF-α、PGE2的含量的影響，旨在探討其可能的解熱機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，級(jí)別：SPF級(jí)；雌雄各半；購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

三陽清解液組：葛根5 g,柴胡12 g,黃芩10 g,生石膏30 g,生梔子10 g,莪術(shù)6 g,生大黃4 g,甘草3 g，以上為1劑量，水煎、過濾和濃縮，制備濃縮成每毫升含生藥80 g的水煎液，裝瓶備用,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)制所需濃度；由鄭州市中醫(yī)院制劑室提供；泰諾林混懸液(對(duì)乙酰氨基酚口服混懸液)，規(guī)格：3.2 g/100 mL，上海強(qiáng)生制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)161223070。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

脂多糖(LPS)(100 mg)，購自索萊寶科技有限公司；氯化鈉注射液(0.45 g，250 mL)，河南太龍藥業(yè)有限公司；大鼠環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、前列腺素E2(PGE2)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒，均購自深圳子科生物科技有限公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

MC-347歐姆龍電子體溫計(jì)，大連歐姆龍有限公司生產(chǎn)TDL80-2B離心機(jī)，SpectraMax190型酶標(biāo)儀(美國熱電)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；HW-1000超級(jí)恒溫水浴，成都泰盟軟件有限公司生產(chǎn)；BT100-2J蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)器，保定蘭格恒流泵有限公司生產(chǎn)。

1.1.5 致熱源及發(fā)熱模型制備

致熱源制備：無菌條件下，用0.9%氯化鈉溶液將脂多糖(LPS)配成20 mg/L注射液，備用。

發(fā)熱模型制備：實(shí)驗(yàn)前12 h，禁食不禁水。灌腸給藥后立即造模：空白組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液1 mL/kg，其余各組大鼠分別腹腔注射的LPS(20 μg/kg，1 mL/kg)建立大鼠發(fā)熱模型。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物篩選、分組及用藥

實(shí)驗(yàn)給藥前，每天上下午定時(shí)(上午8∶30，下午4∶30開始)對(duì)大鼠進(jìn)行適應(yīng)性測(cè)量口腔溫度1次，連續(xù)2 d，取兩次體溫的平均值記為基礎(chǔ)體溫。測(cè)量時(shí)保持時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件的一致性，測(cè)量探頭從大鼠口角插入口腔舌下并保證每次定位角度一致，動(dòng)作輕柔防止體溫應(yīng)激性增高。體溫超過正常范圍或相鄰兩次體溫差值大于0.5℃的動(dòng)物剔除。選用基礎(chǔ)體溫合格的大鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只，雌雄各半。分別為①空白組：腹腔注射生理鹽水1 mL/kg；②模型組：腹腔注射20 μg/kg LPS，1 mL/kg；③對(duì)乙酰氨基酚組：予對(duì)乙酰氨基酚口服混懸液，4 mL/kg灌胃給藥；④三陽清解液組：腹腔注射20 μg/kg LPS，1 mL/kg；30 mL/kg的相應(yīng)藥物約按20滴/min的速度乙狀結(jié)腸滴注給藥。

1.2.2 乙狀結(jié)腸滴注給藥

為了更好地檢驗(yàn)浙江省對(duì)外直接投資對(duì)出口貿(mào)易和進(jìn)口貿(mào)易的不同影響，本文建立如下出口效應(yīng)模型和進(jìn)口效應(yīng)模型:

將篩選好的各組大鼠用固定筒固定好，使其保持安靜狀態(tài)且臀部輕微向上抬起，灌腸給藥前先輕輕擠出直腸內(nèi)殘留的糞便，將藥瓶連接涂有石蠟的一次性滴注導(dǎo)管，將其輕緩插入肛門3 cm，以20～25滴/min的速度滴注給藥，藥物全部滴入后，導(dǎo)尿管停留片刻再輕緩?fù)顺?，并使大鼠繼續(xù)保持灌腸時(shí)的姿勢(shì)，以避免灌腸藥物流出影響藥效。灌腸給藥前12 h各組大鼠禁食不禁水，以減少糞便對(duì)藥物的干擾。

1.2.3 標(biāo)本制備

血標(biāo)本制備：各組大鼠于給藥后6 h將大鼠麻醉后，采用腹主動(dòng)脈采血5 mL留取血標(biāo)本，然后以3 000 r/min，離心15 min，分離血清，置于-80℃冰箱冷凍，待ELISA檢測(cè)用。

下丘腦標(biāo)本的制備：各組大鼠于腹主動(dòng)脈采血后立即斷頭處死動(dòng)物，沿矢狀縫剪開皮膚，剝?nèi)蓚?cè)頂骨、顳骨和硬腦膜，迅速取出腦組織，根據(jù)解剖標(biāo)志(視交叉、乳頭體為前后界，左右下丘腦溝為側(cè)界，深約4 mm)，制備下丘腦組織塊約4 mm×4 mm×4 mm。然后立即把一半下丘腦組織放入凍存管，置液氮中速凍后保存于-80℃冰箱，待ELISA檢測(cè)用。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)

1.3.1 體溫

造模后1、2、3、4、5、6 h測(cè)量口溫，計(jì)算各組大鼠在各測(cè)溫點(diǎn)的升溫值(△T=實(shí)測(cè)體溫-基礎(chǔ)體溫)，測(cè)量體溫的同時(shí)，觀察大鼠皮膚、毛色、肢體、精神狀況、飲食、飲水、大小便、呼吸、體質(zhì)量的變化情況。

1.3.2 下丘腦及血清指標(biāo)

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 給藥6 h內(nèi)各組大鼠體溫變化趨勢(shì)

如表1所示：模型組大鼠體溫明顯上升，與空白組對(duì)比存在顯著性差異(P<0.05)，體溫呈典型的雙峰熱，在2 h、5 h有2個(gè)熱峰，升溫值達(dá)到1.43℃，且實(shí)驗(yàn)過程中觀察到部分發(fā)熱模型大鼠出現(xiàn)精神萎靡、豎毛、寒顫的癥狀，表明LPS發(fā)熱大鼠模型造模成功，與報(bào)道[3-5]相符；與模型組比較，三陽清解液組和對(duì)乙酰氨基酚組體溫下降明顯(P<0.05)；三陽清解液組與對(duì)乙酰氨基酚組在給藥1、2 h退熱效果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ，而在給藥4、5、6 h比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) ，說明三陽清解液組可以顯著降低發(fā)熱大鼠的體溫，且作用時(shí)間長，不易反彈。

2.2 給藥后發(fā)熱大鼠下丘腦cAMP、PGE2含量變化比較

如表2所示：造模給藥6 h后，模型組大鼠下丘腦組織勻漿中cAMP、PGE2含量較空白組顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，對(duì)乙酰氨基酚組能夠明顯減低發(fā)熱大鼠下丘腦組織勻漿中cAMP、PGE2含量(P<0.01)，三陽清解液組對(duì)發(fā)熱大鼠下丘腦組織勻漿中cAMP、PGE2的水平也有一定的抑制作用(P<0.05)；與對(duì)乙酰氨基酚組比較，三陽清解液組下丘腦組織勻漿中cAMP含量，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，PGE2含量，無明顯差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠給藥后不同時(shí)間△T的變化比較℃)

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與對(duì)乙酰氨基酚組比較，☆P<0.05

表2 各組大鼠下丘腦cAMP、PGE2含量變化比較

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與對(duì)乙酰氨基酚組比較，☆P<0.05

2.3 給藥后各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、PGE2含量變化比較

如表3所示：造模給藥6 h后，模型組動(dòng)物血清中IL-1β、TNF-α、PGE2含量較空白組顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，對(duì)乙酰氨基酚組及三陽清解液組能夠明顯減低發(fā)熱大鼠血清中IL-1β、PGE2的含量(P<0.01)，三陽清解液組對(duì)發(fā)熱大鼠血清中TNF-α的水平也有一定的抑制作用(P<0.05)；與對(duì)乙酰氨基酚組比較，三陽清解液組血清中TNF-α差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，而IL-1β、PGE2無明顯差異(P>0.05)。

表3 各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α及PGE2含量變化比較

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與對(duì)乙酰氨基酚組比較，☆P<0.05

3 討論

發(fā)熱是由于發(fā)熱激活物刺激內(nèi)生致熱原細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)生致熱原，內(nèi)生致熱原通過中樞發(fā)熱介質(zhì)作用于體溫調(diào)節(jié)中樞而使體溫調(diào)定點(diǎn)上移而引起的調(diào)節(jié)性體溫升高。PGE2、cAMP是目前公認(rèn)的體溫調(diào)節(jié)中樞發(fā)熱介質(zhì)[6-10]，IL-1β和TNF-α是目前公認(rèn)的可誘導(dǎo)發(fā)熱的重要炎性遞質(zhì)[11-13]，對(duì)乙酰氨基酚屬非甾體抗炎藥，其機(jī)理是抑制體內(nèi)PGE2等的合成，阻止致熱源引起的發(fā)熱反應(yīng)。LPS是目前公認(rèn)的導(dǎo)致發(fā)熱效應(yīng)很強(qiáng)的外源性致熱源之一，是革蘭陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的活性成分，它能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)生性致熱原，引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，從而使體溫升高[14]。諸多研究[15-16]顯示腹腔注射小劑量LPS(20 μg/kg)可成功誘導(dǎo)出大鼠發(fā)熱模型。動(dòng)物注射LPS后可引起下丘腦PGE2、cAMP含量升高，且與體溫升高呈顯著性正相關(guān)[17]，IL-1β和TNF-α作為引起發(fā)熱的重要內(nèi)生致熱源在LPS發(fā)熱中起著重要作用[11-13]。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射LPS建立大鼠發(fā)熱模型，大鼠血清中的TNF-α均顯著性升高，這與Liu等[18]的結(jié)果相一致，注射LPS劑量為20 μg/kg可引起典型的雙峰熱，與王雪峰等[11]報(bào)道一致。

三陽清解液方主要由葛根、柴胡、黃芩、生石膏、生梔子、莪術(shù)、生大黃、甘草等組成。方中葛根辛涼解肌入太陽；柴胡輕清升散，黃芩清瀉相火，和解少陽；大黃蕩滌陽明腑熱；石膏清陽明氣分之實(shí)熱；梔子苦寒，能清三焦?jié)駸?；莪術(shù)活血化瘀、消積行氣；全方共奏辛涼解表、和解少陽、清瀉陽明之效。采用乙狀結(jié)腸滴注的給藥途徑，有效解決了“小兒吃藥怕苦、打針怕疼”的難題，大大提高了依從性；在研究前期我們發(fā)現(xiàn)三陽清解液乙狀結(jié)腸滴注時(shí)反復(fù)測(cè)肛溫會(huì)刺激大鼠肛門，致灌腸藥物流出，為了不影響藥物效果及體溫測(cè)定，我們采用測(cè)口溫的方法；同時(shí)采用恒溫水浴保證藥物在37.0℃左右，避免了溫度過高、過低對(duì)大鼠造成不適；另外，采用恒流泵泵入的方法解決大鼠在灌腸過程中因?yàn)楦箟哼^大等，造成滴注緩慢或不滴等問題，經(jīng)過以上技術(shù)上的改良，保證了實(shí)驗(yàn)的合理性及可操作性；相關(guān)前期研究發(fā)現(xiàn)[1]三陽清解液乙狀結(jié)腸滴注對(duì)LPS誘導(dǎo)的發(fā)熱模型大鼠有良好的解熱作用，且有較好的劑量依賴性，其解熱效果可能與其抑制發(fā)熱大鼠血清中IL-6、MIP-1的含量相關(guān)，本研究在此基礎(chǔ)上調(diào)整實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，完善相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)，以期通過觀察三陽清解液對(duì)LPS誘導(dǎo)發(fā)熱模型大鼠體溫及下丘腦中發(fā)熱介質(zhì)和血清中致熱因子含量的影響，探討其可能的解熱機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)LPS造模后大鼠呈典型的雙峰熱，模型組大鼠體溫明顯上升(P<0.05)，提示造模成功；三陽清解液能明顯降低發(fā)熱大鼠體溫，三陽清解液組與對(duì)乙酰氨基酚組在給藥1、2 h退熱效果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ，而在給藥4、5、6 h比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) ，說明三陽清解液組可以顯著降低發(fā)熱大鼠的體溫，且作用時(shí)間長，不易反彈；與空白組比較，模型組大鼠下丘腦cAMP、PGE2及血清IL-1β、TNF-α、PGE2含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，對(duì)乙酰氨基酚及三陽清解液組大鼠下丘腦cAMP、PGE2及血清IL-1β、TNF-α、PGE2含量顯著下降(P<0.05)，其中三陽清解液組下丘腦PGE2及血清IL-1β、PGE2與對(duì)乙酰氨基酚組無顯著差異(P>0.05)。

綜上所述，三陽清解液對(duì)LPS誘導(dǎo)的發(fā)熱大鼠模型有良好的解熱作用，且作用穩(wěn)定持久，其機(jī)制可能與通過下調(diào)大鼠下丘腦cAMP、PGE2水平，從而抑制血清IL-1β、TNF-α、PGE2的表達(dá)有關(guān)。