中醫(yī)病證相符的大鼠瘡瘍模型的建立及其血漿、尿液代謝組學(xué)研究

陳德軒，蔡紅蝶，宿樹蘭,朱永康*

(1．南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

中醫(yī)外科學(xué)古代稱為“瘍科”，體表感染性疾病在其中占有重要位置，中醫(yī)外科的內(nèi)外治法都是圍繞體表感染類疾病(瘡瘍)展開論述的；中醫(yī)現(xiàn)代化進(jìn)程中，針對很多經(jīng)典方藥及瘡瘍類疾病的實(shí)驗(yàn)研究必然用到體表感染模型，體表感染模型的建立是相關(guān)研究的基礎(chǔ)。

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)研究不可缺少的重要組成，代謝組學(xué)被視為生物體整體功能狀態(tài)的“生化表型”，能夠即時(shí)、靈敏、客觀表征生物在各種外界因素的刺激下體整體功能狀態(tài)的應(yīng)答與調(diào)節(jié)[1]。目前多成分與多作用靶點(diǎn)藥物顯示出明顯的作用優(yōu)勢，傳統(tǒng)中醫(yī)藥的整體觀也越來越受到更多重視。因而，建立符合傳統(tǒng)中醫(yī)藥自身特點(diǎn)、能夠科學(xué)表征其整體療效的藥效學(xué)評價(jià)體系，揭示中醫(yī)藥多組分、多靶點(diǎn)協(xié)同整合機(jī)制，是研究中醫(yī)藥的重中之重。近年來，代謝組學(xué)越來越多地應(yīng)用于中醫(yī)“證候”本質(zhì)的揭示[2]、方劑整體療效的作用機(jī)制[3]以及中藥安全性評價(jià)等等方面，能夠客觀地闡明中醫(yī)藥的臨床治療原理。

本文在前人研究基礎(chǔ)上[4]，根據(jù)病證相符的原則，采用膠帶表皮剝脫加金葡菌菌液注射方法制備大鼠體表感染模型，該模型具有“陽證瘡瘍”成膿期的典型表現(xiàn)，可以用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。并進(jìn)一步運(yùn)用血漿、尿液代謝組學(xué)方法揭示體表感染模型大鼠的內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物的變化，從體內(nèi)代謝角度闡明該模型的科學(xué)性和合理性。以期為同類研究提供技術(shù)方法支撐和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD大鼠20只，6～7周齡，體質(zhì)量200～220 g，雌雄各半，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號碼SCXK(蘇)2012-0004。飼養(yǎng)及無菌手術(shù)在該中心進(jìn)行，溫度、濕度正常。

1.1.2 試劑與儀器

感染細(xì)菌菌種：金黃色葡萄球菌ACTT 25923，濃度1×108個(gè)/mL，由江蘇省中醫(yī)院細(xì)菌室提供。實(shí)驗(yàn)藥物麻醉劑：水合氯醛，江蘇省中醫(yī)院制劑中心，批號：2014080。光學(xué)顯微鏡( Olympus，日本)江蘇省中醫(yī)院病理實(shí)驗(yàn)中心提供。超高效液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜儀聯(lián)用(UHPLC-Q-TOF/MS)分析條件及工作站等：江蘇省方劑研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組及模型制備

20只大鼠隨機(jī)分為兩組，每組10只。正常組，表皮剝脫，皮下多點(diǎn)注射生理鹽水；模型組，表皮剝脫，滴注菌液，并皮下多點(diǎn)注射菌液。

體表感染模型：采用膠帶剝脫法[4]加皮下多點(diǎn)注射菌液法復(fù)制大鼠體表感染模型。實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，分別在腹腔內(nèi)注射10%水合氯酸麻醉(劑量為3 mL/kg)，選擇背部皮膚作為實(shí)驗(yàn)區(qū)域，使用電動剃毛器剃去背部毛發(fā)約3.0 cm×3.0 cm，以寬約2 cm膠帶連續(xù)粘扯背部軟毛，約30次左右脫去毛發(fā)和表皮層，以潮紅光亮見滲出輕微血滴為度，去除面積約3 cm2左右。滴注菌液組10只大鼠即刻于表皮剝脫處以取樣器滴注5 μL含108金黃色葡萄球菌菌液。放置入飼養(yǎng)籠等待自然蘇醒。以后3 d，每天于剝脫表皮正中注射金黃色葡萄球菌108個(gè)/mL×0.5 mL，并在感染區(qū)域2 cm2周圍選取多點(diǎn)行皮下注射菌液。約至第4天背部注射部位出現(xiàn)明顯紅腫、皮薄光亮、點(diǎn)壓有軟化，有膿液為造模成功。正常組行相應(yīng)剝脫、注射，僅注射等量的注射用生理鹽水。

1.2.2 樣本收集與處理

(1)隨機(jī)10只大鼠造模前1 d通過眼眶靜脈取血，并通過代謝籠收集10只大鼠的24 h尿液樣本。造模后的第4天，2組再分別取血和收集大鼠的尿液。取樣經(jīng)離心取血漿后，分組標(biāo)記后儲存于-70℃的環(huán)境中，留待后續(xù)分析處理。所有血漿樣品均用3倍量乙腈沉蛋白。將100 μL的血漿，加入到300 μL的乙腈溶液當(dāng)中，通過渦漩混勻1 min，13 000 r/min高速離心處理10 min后，取上清液過0.22 μm濾膜，各取2 μL濾液進(jìn)樣UHPLC-Q-TOF/MS。尿液樣品在3 000 rpm離心10 min以除去固體雜質(zhì),取上清液按體積比1∶2加入磷酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1Na2HPO4/0.2 mol·L-1NaH2PO4)，靜置10 min，再于同樣條件下13 000 rpm，離心10 min，所有尿液樣品過0.22 μm濾膜，各取上層清夜2 μL進(jìn)樣UPLC-Q-TOF-MS分析。

(2)造模完成后，5只大鼠腹腔內(nèi)注射麻醉，取背部瘡瘍形成部位靠近中心部的包括皮膚至肌層各層組織約0.5～1 cm2，4%多聚甲醛分組固定，分別行HE染色和革蘭氏染色，制作病理標(biāo)本。

1.2.3 觀察指標(biāo)

(1)觀察一般情況: 每日觀察各組大鼠行為活動、糞便性狀、瘡面形態(tài)、顏色等。

(2)病理切片檢測：觀察病理切片的急性炎癥反應(yīng)、中性粒細(xì)胞浸潤、單核細(xì)胞浸潤、細(xì)菌殘留情況等。

(3)造模前后的血漿和尿液代謝輪廓變化。

1.2.4 UHPLC-Q-TOF/MS分析條件

色譜條件：ACQUITF UHPLC BEH-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美國Water公司)；流動相：A(0.1%甲酸水溶液)，B(乙腈)；血漿樣品梯度洗脫：0～3 min，B:5%～45%；3～13 min，B:45%～95%；13～14 min，B:95%；14～14.1 min，B:95%～5%。尿液樣品梯度洗脫：0～8 min，B:5%～30%；8～11 min，B:30%～70%；11～13 min，B:70%～95%；13～14 min，B:95%；14～14.1 min，B:95%～5%。

質(zhì)譜檢測條件：ESI+模式下，源溫度：120℃，脫溶劑氣溫度：400℃，毛細(xì)管電壓：4 000 V，錐孔電壓：30 V。錐孔氣流量：50 L/h，脫溶劑流量：900 L/h；掃描時(shí)間：0.3 s；質(zhì)量掃描范圍：100～1 000 m/z。ESI-模式下，源溫度：120℃，脫溶劑氣溫度：350℃，毛細(xì)管電壓：3 000 V，錐孔電壓：40 V。錐孔氣流量：50 L/h，脫溶劑流量：600 L/h；掃描時(shí)間：0.3 s；質(zhì)量掃描范圍：100～1 000 m/z。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

利用Masslynx 4.1工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，并對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)、正交校正的偏最小二乘、判別分析(OPLS-DA)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及創(chuàng)面情況

正常組整體狀態(tài)較好，活動靈敏，造模前后均無明顯的蜷縮、少食等現(xiàn)象。模型組隨著菌液注射體質(zhì)量增長不明顯，逐漸出現(xiàn)蜷縮、少食，尿液深黃、尿少，大便稀溏、腥臭或干結(jié)糞便等。正常組的局部創(chuàng)面在連續(xù)3 d的注射后見少量的皮膚稍顯潮紅，稍隆起水腫，無明顯的漿液性或膿性分泌物。模型組局部創(chuàng)面在滴、注菌液后的第2天即出現(xiàn)皮膚潮紅、有淺表膿點(diǎn)出現(xiàn)，稍腫脹，至注射后的第4天局部出現(xiàn)隆起，顏色焮紅，表皮剝脫，見漿液性或膿性分泌物，出現(xiàn)膿點(diǎn)，部分按壓后有局部軟化、輕微的波動感覺。根據(jù)全身出現(xiàn)的蜷縮、尿黃、糞便干結(jié)和局部的焮紅、軟化、膿液形成等現(xiàn)象，此時(shí)符合中醫(yī)陽證瘡瘍的中期證候表現(xiàn)。直觀上造模成功。

繼續(xù)觀察至造模后的1周左右，造模組局部和全身癥狀均明顯減輕或消失，說明大鼠對局部感染的自愈能力較強(qiáng)。兩組均未出現(xiàn)大鼠死亡現(xiàn)象。

2.2 創(chuàng)面肉芽組織病理染色結(jié)果

2.2.1 正常組第4天病理切片

由圖1A蘇木素-伊紅染色(100倍)病理切片圖可看出，大鼠表皮局部糜爛，炎性滲出形成，鱗狀上皮灶性脫落，中度急慢性炎細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞為主。毛囊及脈管周少許炎細(xì)胞浸潤。圖1B革蘭氏染色(100倍)顯示，表皮炎性滲出物中見散在革蘭陽性菌。

圖1 正常組第4天病理切片

2.2.2 模型組第4天局部組織病理切片

圖1C蘇木素-伊紅染色(100倍)顯示，大鼠表皮局部糜爛，鱗狀上皮灶性脫落，重度急慢性炎細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞為主。毛囊及脈管周炎細(xì)胞浸潤。圖1D革蘭氏染色(100倍)表皮炎性滲出物中見大量革蘭陽性菌，真皮纖維組織中小灶區(qū)域見少許革蘭陽性菌浸潤。

2.3 造模前后大鼠血漿代謝輪廓分析

采用UPLC-QTOF/MS在正、負(fù)離子模式下采集正常組與模型組大鼠血漿的典型總離子流圖。如圖2所示，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)均得到良好的分離，且實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫笱獫{的圖譜與正常組大鼠血漿的圖譜存在一定的差異。為了進(jìn)一步檢測大鼠體表感染模型的代謝輪廓的變化情況，對正常組和體表感染模型大鼠的血漿代謝譜的數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識別，如PCA和OPLS-DA，見圖3。PCA圖可以看出正常組與模型組大鼠血漿代謝譜分為兩類，兩者明顯區(qū)分。OPLS-DA圖可以看出正常與模型大鼠的血漿生物樣品呈現(xiàn)聚攏狀態(tài)，且區(qū)分明顯。

圖2 正常和模型大鼠血漿生物樣品在ESI+/ESI-模式下的色譜圖

2.4 造模前后大鼠尿液代謝輪廓分析

采用UPLC-QTOF/MS在正、負(fù)離子模式下采集正常組與模型組大鼠尿液的典型總離子流圖。如圖4所示，尿液中內(nèi)源性物質(zhì)均得到良好的分離，且模型大鼠尿液的圖譜與正常大鼠血漿的圖譜存在一定的差異。為了進(jìn)一步檢測大鼠體表感染模型的代謝輪廓的變化情況，對正常組和體表感染模型大鼠的尿液代謝譜的數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識別，如PCA和OPLS-DA，見圖5。PCA圖可以看出正常組與模型組大鼠尿液代謝譜分為兩類，兩者明顯區(qū)分。OPLS-DA圖可以看出正常與模型大鼠的尿液生物樣品呈現(xiàn)聚攏狀態(tài)，且區(qū)分明顯。

注:A,E.PCA圖(2D圖)；B,F.OPLS-DA圖(2D圖)；C,G.PCA圖(3D圖)；D,H.OPLS-DA圖(3D圖)；A,B,C,D為ESI-模式；E,F,G,H為ESI+模式圖3 大鼠血漿生物樣品在ESI+/ESI-模式下的PCA及OPLS-DA圖

圖4 正常和模型大鼠尿液生物樣品在ESI+/ESI-模式下的色譜圖

注:A,E.PCA圖(2D圖)；B,F.OPLS-DA圖(2D圖)；C,G.PCA圖(3D圖)；D,H.OPLS-DA圖(3D圖)；A,B,C,D為ESI-模式；E,F,G,H為ESI+模式圖5 大鼠尿液生物樣品在ESI+/ESI-模式下的PCA及OPLS-DA圖

3 討論

本研究按照“膠帶剝脫法”加皮下多點(diǎn)注射菌液法完成實(shí)驗(yàn)動物模型的建立。將大鼠腹腔麻醉局部褪毛后以市售透明膠帶紙于大鼠背部大約粘扯30次左右后面積約3 cm2，即可導(dǎo)致大鼠表皮脫落，局部皮膚光亮、潮紅、見滲血點(diǎn)而無廣泛血液滲出，顯露真皮層，滴注菌液約后待麻醉動物蘇醒，菌液基本吸收，予以單籠飼養(yǎng)大鼠，以避免大鼠之間相互舔舐傷口影響藥物的療效。以后每天同一時(shí)間局部皮下再注射菌液，連續(xù)3 d。造模第4天觀察造模效果整體良好，感染情況明顯，出現(xiàn)較典型的局部紅熱腫脹現(xiàn)象，從全身及局部考察符合中醫(yī)外科陽證瘡瘍的特點(diǎn)，局部感染組織經(jīng)病理切片證實(shí)為明顯的炎癥反應(yīng)。從組織病理切片顯示來看，模型大鼠的皮膚壞死明顯，表面有大量的炎性滲出物及壞死物，大量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤，符合體表感染的病理變化。通過代謝組學(xué)方法驗(yàn)證分析發(fā)現(xiàn)，模型組的血漿和尿液在OPLS-DA圖上均呈現(xiàn)聚攏狀態(tài)且與空白組完全分開，偏離正常狀態(tài)，為模型造模成功提供明確的佐證。該造模方法取得成功，并未出現(xiàn)大鼠死亡。

中醫(yī)證候動物模型的建立與研究是聯(lián)系中醫(yī)基礎(chǔ)和臨床的橋梁和紐帶，是有效中藥的篩選、藥物作用機(jī)制深入研究的基礎(chǔ)[5]，模型制作成功與否，直接影響實(shí)驗(yàn)的過程與結(jié)果，一種符合中醫(yī)證候特點(diǎn)的瘡瘍中期感染模型的復(fù)制顯得必要。目前體表感染模型(瘡瘍)的制作有金葡菌直接注射法[6]、十字切開注射法[7-11]和表皮剝脫菌液滴注法[12]等，均可不同程度地引起局部的感染證候，但由于動物的抗感染能力較強(qiáng)，比較難復(fù)制出瘡瘍中期(膿腫期)的模型，經(jīng)過反復(fù)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，本次研究采用Elisabeth Kugelberg 等[4]設(shè)計(jì)的膠帶表皮剝脫加皮下連續(xù)注射的方法制作模型，目的是造成連續(xù)感染，使得感染模型進(jìn)入瘡瘍中期階段，以滿足實(shí)驗(yàn)需求。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究中，可根據(jù)需要減少注射次數(shù)和初次菌液滴注量和吸收時(shí)間等，可獲得不同感染程度的局部瘡瘍模型，供不同的實(shí)驗(yàn)需要。

中醫(yī)證候動物模型的建立與評價(jià)經(jīng)歷了較長時(shí)間的發(fā)展，現(xiàn)在仍處于探索的階段，也存在著許多的問題和爭議，這主要源于證本質(zhì)研究尚未完善，臨床診斷信息無法應(yīng)用于動物模型評價(jià)中。學(xué)術(shù)界公認(rèn)的較客觀地評價(jià)中醫(yī)證候的指標(biāo)并不多，且缺乏特異性等。代謝組學(xué)是一種采用系統(tǒng)生物學(xué)思路研究代謝小分子組的高通量的分析方法，通過比較不同條件下相關(guān)小分子的代謝圖譜，找到具有差別意義的生物標(biāo)志物[13-14]，為客觀評價(jià)中醫(yī)證候模型提供了不同的思路與依據(jù)，代謝組學(xué)整體性、動態(tài)性、系統(tǒng)性特點(diǎn)與中醫(yī)基本理論非常吻合，在中醫(yī)證候動物模型研究領(lǐng)域中展現(xiàn)出很重要應(yīng)用前景，對中醫(yī)藥現(xiàn)代化的實(shí)現(xiàn)起到有力的推動作用[15]。利用代謝組學(xué)對中醫(yī)證候動物模型進(jìn)行研究，具有方法論的高度契合性、學(xué)術(shù)思想的有效相通性和研究方法的一致性等特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，將會是今后研究的熱點(diǎn)和趨勢。應(yīng)用代謝組學(xué)來研究、評價(jià)和指導(dǎo)建立中醫(yī)證候動物模型，通過代謝組與生物體功能狀態(tài)關(guān)系的建立，能夠比較有效地克服目前證候動物模型證候難以判定的難題，同時(shí)又可指導(dǎo)中醫(yī)證候動物模型的創(chuàng)制，有希望進(jìn)一步推進(jìn)中醫(yī)證候動物模型的復(fù)制以及中醫(yī)證候本質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化的研究[16]。