火龍果莖中3種主要甾醇的提取工藝研究①

付調(diào)坤 周 偉 夏 文 付 瓊 李積華③

(1 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東湛江524001;2 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所 廣東湛江524091;3 海南省果蔬貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東湛江524001)

火龍果（Hylocereus undatus）是仙人掌科三角柱屬（又名量天尺屬）的果用栽培品種，其莖深綠色，粗壯，三棱狀，棱邊緣有刺座，花大型，漿果長(zhǎng)圓形，原產(chǎn)于巴西、墨西哥等中美洲熱帶沙漠地區(qū)［1]，國內(nèi)目前已在廣西、廣東、海南、福建等地區(qū)大規(guī)模種植?；瘕埞o為肉質(zhì)莖，橫切面為三角形，表層覆蓋較厚的角質(zhì)層，色澤隨成熟老化由淺黃綠色變?yōu)樯罹G色，角質(zhì)層內(nèi)部是凝膠狀組織?；瘕埞N植行業(yè)每年修剪下的火龍果莖的量與果實(shí)的產(chǎn)量相當(dāng)，火龍果莖目前作為一種廢棄物被扔掉，對(duì)其利用很少［2]。

植物甾醇（Phytostero） 是一種類似于環(huán)狀醇結(jié)構(gòu)的天然活性物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)與動(dòng)物間的膽固醇相似，是植物代謝的一個(gè)終產(chǎn)物。它廣泛存在于各種植物油、堅(jiān)果和植物種子中，也存在于其他植物性食物如蔬菜、水果中［3]。火龍果莖中含有多種植物甾醇［4]，如蒲公英甾醇、菜籽甾醇、β-谷甾醇、麥角甾醇、豆甾醇等。植物甾醇是一類具有生理活性的物質(zhì)，具有多種功效，首先它能夠抑制人體對(duì)膽固醇的吸收及生化合成，促進(jìn)膽固醇的降解代謝，降低膽固醇吸收［5-6]。因此，植物甾醇可用于預(yù)防治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化類的心臟?。?-8]。其次，植物甾醇還具有抑制血小板凝聚和抑制癌細(xì)胞增殖的作用，以及抗炎、抗菌等功能，可促進(jìn)傷口愈合，增強(qiáng)毛細(xì)血管循環(huán)，對(duì)治療潰瘍有明顯的療效，被用作治療各種癌癥如乳腺癌、前列腺癌、腸癌等的輔助治療藥物［9-10]。同時(shí)，植物甾醇中含有親水基團(tuán)和親油基團(tuán)，具有良好的乳化性，可用作外觀改良劑、稠度改良劑、粘度控制劑、緩沖劑和微乳化劑等。另外，植物甾醇還具有良好的抗氧化性，可作食品添加劑（抗氧化劑、營養(yǎng)添加劑等）；也可作為動(dòng)物生長(zhǎng)劑原料，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)［11-12]。綜上所述，植物甾醇在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域中都有廣泛應(yīng)用，具有極大的開發(fā)價(jià)值［13]。

隨著國家對(duì)農(nóng)業(yè)可再生天然資源開發(fā)利用的重視，熱帶農(nóng)作物廢棄物資源的高值化應(yīng)用和廢棄物回收再利用成為研究的熱點(diǎn)。本文以大宗熱帶廢棄資源火龍果莖為研究對(duì)象，采用超聲波輔助萃取法來提取火龍果莖中的3種主要甾醇，并對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化［14-15]。為火龍果莖的深度開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考，也為熱帶農(nóng)作物及其廢棄物的高值化利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

火龍果莖原料：火龍果莖品種為臺(tái)農(nóng)3號(hào)（玫瑰紅），取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所。

1.1.2 儀器

真空冷凍干燥機(jī)（德國CHRIST，ALPHA2-4），精密分析天平（德國賽多利斯，CPA225D），高速多功能粉碎機(jī)（武義海納，CS-700），超聲波反應(yīng)器（上?？茖?dǎo)，SK2210LHC），低溫高速離心機(jī)（德 國Sigma， 3-30K）， 氮 吹 儀（美 國Or‐ganomation，N-EVAP-24），高效液相色譜儀（日本島津，LC-20A）。

1.1.3 試劑

麥角甾醇、豆甾醇、β‐谷甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、蒲公英甾醇等6種甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司），95%乙醇（分析純，廣東光華科技股份有限公司），無水甲醇（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司），甲醇（色譜純，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 火龍果莖原料的預(yù)處理

將新鮮的火龍果莖洗凈后去刺，去除中心的木質(zhì)化莖，將余下的肉質(zhì)莖部分切成3～5 mm 的小塊，然后在真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，凍干條件為-80℃，0.1 mbar，冷凍干燥48 h 后將凍干好的火龍果莖用高速粉碎機(jī)打成粉末，即為火龍果莖凍干粉末，裝入自封袋中，放入干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 火龍果莖甾醇樣品的處理

準(zhǔn)確稱取一定量的火龍果莖凍干粉末于三角瓶中，按一定液固比（mL/g）加入95%乙醇置于超聲波反應(yīng)器中超聲提取，然后高速離心（10000 r/min×15 min）除去濾渣取上清液，即為火龍果莖甾醇提取液。

1.2.3 高效液相色譜法測(cè)火龍果莖甾醇含量

（1） 色譜柱 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 （4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇；流速：0.7 mL/min；柱溫：35 ℃，檢查波長(zhǎng)：210 nm，進(jìn)樣量：20 μL。

（2） 各種甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，在本研究的實(shí)驗(yàn)條件下，火龍果莖中總共檢測(cè)到5種甾醇，分別是麥角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、菜籽甾醇和蒲公英甾醇。準(zhǔn)確稱量這5種甾醇的標(biāo)準(zhǔn)品各25 mg，置于25 mL容量瓶中，無水甲醇溶解定容，配置成1 mg/mL 的甾醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用逐級(jí)稀釋法配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)甾醇溶液，分別準(zhǔn)確移取1、2、3、4、5 mL 甾醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液于5 mL 容量瓶中，用無水甲醇定容。按照色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行3次進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量為20 μL。分別以峰面積、甾醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)、橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3） 分別精密稱取1 mg的麥角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、菜籽甾醇、蒲公英甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，用無水甲醇溶解并混合，定容至2 mL。按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得到混標(biāo)色譜圖。

（4） 將1.2.2 中的火龍果莖甾醇提取液用氮吹儀吹48 h，吹干后用無水甲醇溶解，定容至3 mL，準(zhǔn)確移取1.5 mL 樣品至樣品瓶中，按照色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上以95%乙醇為最佳提取溶劑，超聲功率固定100 W，選取超聲提取溫度、液固比（mL/g）、超聲提取時(shí)間3個(gè)因素，考察各因素對(duì)火龍果莖中甾醇提取含量的影響，確定其最佳因素水平。其他因素條件固定，依次分別以超聲提取溫 度（35、40、45、50、55、60℃）、液 固比（mL/g）（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1）和超聲提取時(shí)間（30、60、90、120、150、180 min）為單因素，在不同水平上進(jìn)行單因素分析，以確定響應(yīng)曲面的最優(yōu)因素水平。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過單因素實(shí)驗(yàn)考察，確定Box-Behnken 響應(yīng)面法考察的因素分別為超聲提取溫度、液固比（mL/g）和超聲提取時(shí)間。采用3 因素3 水平的Box-Behnken 響應(yīng)面分析法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)定的因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平編碼值

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以O(shè)rigin 8.6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 各種甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別以峰面積、甾醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)、橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中麥角甾醇曲線的回歸方程為：y=11417858.5000x-233800.3000，相關(guān)系數(shù)R2=0.9996；豆甾醇曲線的回歸方程為：y=6694590.5000x+208602.3000，相關(guān)系數(shù)R2=0.9906；β-谷甾醇曲線的回歸方程為：y=5074077.0000x-50681.6000，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992；菜籽甾醇曲線的回歸方程為：y=7931156.5000x-135202.7000 相關(guān)系數(shù)R2=0.9946；蒲公英甾醇曲線的回歸方程為：y=14169061.5000x-165694.7000 相關(guān)系數(shù)R2=0.9906，所得回歸方程線性關(guān)系均良好。

2.2 HPLC色譜圖

從圖1、2對(duì)比可知，圖2中的5個(gè)峰的出峰時(shí)間與圖1 中的5 個(gè)峰的出峰時(shí)間一一對(duì)應(yīng)，因此可以確定，樣品的HPLC 色譜圖中，按出峰時(shí)間先后順序分別為：麥角甾醇、菜籽甾醇、豆甾醇、蒲公英甾醇、β-谷甾醇。但是由于樣品中可能含有其他雜質(zhì)，所以保留時(shí)間稍有差別。

圖1 5種甾醇的混標(biāo)HPLC色譜圖

圖2 樣品的HPLC色譜圖

根據(jù)2.1 中的各甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算，得到樣品中不同甾醇的含量，見圖3。

由圖3可知，火龍果莖中甾醇含量豆甾醇＞麥角甾醇＞β-谷甾醇＞蒲公英甾醇＞菜籽甾醇，故選取含量最高的3種甾醇（豆甾醇、麥角甾醇、β-谷甾醇）作為所需的目標(biāo)甾醇。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 超聲提取溫度對(duì)火龍果莖甾醇含量的影響

從圖4可以看出，麥角甾醇的含量隨著溫度的升高而增加，在45℃時(shí)達(dá)到最高值，45℃之后麥角甾醇的含量逐漸減小然后趨于平穩(wěn)；豆甾醇的含量在35～50℃波動(dòng)不大，55℃時(shí)達(dá)到最高值，55℃之后呈下降趨勢(shì)；β-谷甾醇的含量隨著溫度的升高而增加，在50℃達(dá)到最高值，之后β-谷甾醇的含量都是隨著溫度的增加呈下降趨勢(shì)然后趨于平穩(wěn)；總的來說，這3種甾醇的含量隨著溫度的升高先呈上升趨勢(shì)，到達(dá)最高值之后開始下降逐漸趨于平穩(wěn)，造成這種趨勢(shì)的原因可能是隨著溫度的升高，甾醇的溶解度增大，一開始呈上升趨勢(shì)，隨著溫度繼續(xù)升高，甾醇分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞了，導(dǎo)致甾醇性質(zhì)發(fā)生改變［16]，所以達(dá)到最高值后甾醇含量開始呈下降趨勢(shì)。麥角甾醇在超聲提取溫度為45℃時(shí)提取含量最高；豆甾醇在超聲提取溫度為55℃時(shí)提取含量最高；β-谷甾醇在超聲提取溫度為50℃時(shí)提取含量最高；綜合來看，麥角甾醇與豆甾醇在50℃時(shí)的提取含量與各自的最高提取含量相差不大，所以選取溫度50℃為最佳超聲提取溫度。

圖3 高效液相法測(cè)樣品中不同甾醇的含量

2.3.2 液固比對(duì)火龍果莖甾醇含量的影響

結(jié)果見圖5。

從圖5可知，麥角甾醇的提取含量隨著液固比的增加而增加，當(dāng)液固比為20∶1 時(shí)，達(dá)到最高值。β-谷甾醇的提取含量隨著液固比的增加也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在液固比為30∶1 時(shí)，達(dá)到最高值。這可能因?yàn)槭请S著提取溶劑體積的增加，樣品與溶劑混合的更充分，溶出的植物甾醇含量也隨之增多，所以麥角甾醇和β-谷甾醇的提取含量也隨之提高，當(dāng)麥角甾醇和β-谷甾醇的液固比分別為20∶1 和30∶1 時(shí)，達(dá)到其最高提取含量，這時(shí)甾醇已經(jīng)基本提取完全［17]，繼續(xù)增大液固比反而會(huì)降低甾醇濃度。豆甾醇的提取含量在液固比10∶1為最高值，之后開始減小，15∶1～30∶1 呈緩慢上升趨勢(shì)逐漸趨于平穩(wěn)，導(dǎo)致出現(xiàn)豆甾醇含量下降趨勢(shì)的原因可能是有其他雜質(zhì)被提取出來，所以豆甾醇含量在1∶10 之后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，1∶15～1∶30 呈緩慢上升趨勢(shì)，可能是豆甾醇被提取完全了。綜合來看，液固比為30∶1時(shí)，β-谷甾醇的提取含量最高，且豆甾醇和麥角甾醇在此液固比下的提取含量相比各自的最高提取含量相差較小，故選取30∶1作為最佳提取液固比。

圖4 超聲提取溫度對(duì)火龍果莖甾醇含量的影響

圖5 液固比對(duì)火龍果莖甾醇含量的影響

2.3.3 超聲提取時(shí)間對(duì)火龍果莖甾醇含量的影響

結(jié)果見圖6。

圖6 超聲提取時(shí)間對(duì)火龍果莖甾醇含量的影響

從圖6 中可知，麥角甾醇在提取時(shí)間為60 min時(shí)提取含量最高，然而豆甾醇和β-谷甾醇相比麥角甾醇需要更多的提取時(shí)間，分別在180 和150 min 得到最高的提取含量。這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過短時(shí)，火龍果莖的細(xì)胞壁沒有完全破裂，其中的豆甾醇和β-谷甾醇溶解不充分，使得其提取不夠完全，而隨著超聲提取時(shí)間的增加，細(xì)胞破碎程度增加，細(xì)胞內(nèi)部的甾醇物質(zhì)開始向外擴(kuò)散，因此甾醇的提取含量增加。但當(dāng)甾醇達(dá)到其最高提取含量時(shí)，隨著超聲提取時(shí)間的增加，甾醇可能會(huì)被破壞，從而使提取含量降低［18]。綜合來看，β-谷甾醇在超聲提取時(shí)間為150 min時(shí)提取含量最高；麥角甾醇與豆甾醇在超聲提取時(shí)間為150 min時(shí)的提取含量與各自的最高提取含量相差不大，所以選取150 min作為最佳超聲提取時(shí)間。

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

本次實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)為麥角甾醇含量、豆甾醇含量、β-谷甾醇含量。因?yàn)檫x取的3個(gè)指標(biāo)（麥角甾醇含量、豆甾醇含量、β-谷甾醇含量）的重要性一樣，所以以Y表示實(shí)驗(yàn)中指標(biāo)的測(cè)定值指標(biāo)隸屬度＝該公式中Y表示指標(biāo)值，Ymax表示最大指標(biāo)值，Ymin表示最小指標(biāo)值，直接將上述的3個(gè)指標(biāo)的隸屬度相加作為綜合評(píng)分，利用綜合評(píng)分對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用Design Expert 8.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程如下：

綜合評(píng)分＝2.14＋0.59A－0.23B＋0.26C-0.71A2－0.19B2－0.16C2－0.014AB＋0.062AC＋0.26BC

回歸方程一次項(xiàng)中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向。由方程可知，影響甾醇指標(biāo)性成分的因素的主次順序?yàn)锳＞C＞B。進(jìn)一步對(duì)方程進(jìn)行回歸方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析

由表3的分析結(jié)果可以看出，模型F＝7.98，p＝0.0061＜0.01，說明回歸方程極顯著，擬合度很好，實(shí)驗(yàn)具有很高的可信性和準(zhǔn)確性；失擬項(xiàng)F＝3.62，p＝0.123＞0.05（不顯著），說明實(shí)驗(yàn)誤差很小，因此可以用此模型分析和預(yù)測(cè)火龍果莖中甾醇的提取工藝的結(jié)果。由表3 中F值可知，模型中一次項(xiàng)影響甾醇含量的主次因素是A＞C＞B，交互項(xiàng)均不顯著，二次項(xiàng)A2極顯著（p＜0.01），其余均不顯著。將因變量與另外2個(gè)因素?cái)M合為三維曲面圖，因?yàn)橹荒鼙磉_(dá)含2個(gè)因素變量的函數(shù)，所以固定3個(gè)因素之一為中值，將中心點(diǎn)值代入二次回歸模型方程得到新方程，根據(jù)新模型方程得到響應(yīng)面三維圖，結(jié)果見圖7。

經(jīng)過Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件，得到最優(yōu)工藝條件為：超聲提取溫度53.61℃、超聲提取時(shí)間168.45 min、液固比17.10∶1，試驗(yàn)預(yù)測(cè)綜合評(píng)分為2.3743。依據(jù)最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到最優(yōu)工藝條件下火龍果莖甾醇含量為：麥角甾醇含量為179.08 mg/hg，豆甾醇含量為156.02 mg/hg，β-谷甾醇含量為54.89 mg/hg，總甾醇含量為389.99 mg/hg，綜合評(píng)分為2.3633，這與理論綜合評(píng)分2.3743 相比無顯著性差異。因此采用Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到的甾醇提取工藝準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

植物甾醇作為一種具有重要生理功能的活性物質(zhì)，有著廣泛的用途?；瘕埞o作為一種農(nóng)業(yè)廢棄資源，是提取植物甾醇的一個(gè)良好來源，以它為原料提取甾醇，既可以實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄資源的高值化應(yīng)用，又可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本研究以火龍果莖為原料，采用超聲波輔助萃取法來提取火龍果莖中的3 種主要甾醇（麥角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇），通過單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，對(duì)影響3 種主要甾醇提取含量的主要因素進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，影響火龍果莖甾醇含量的主次因素是超聲提取溫度＞超聲提取時(shí)間＞液固比。通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝，得到的最優(yōu)工藝條件為：以95%乙醇為提取溶劑，超聲功率100 W，超聲提取溫度53.61℃、超聲提取時(shí)間168.45 min、液固比17.10∶1；在最優(yōu)工藝條件下火龍果莖甾醇含量為：麥角甾醇含量為179.08 mg/hg，豆甾醇含量為156.02 mg/hg，β-谷甾醇含量為54.89 mg/hg，總甾醇含量為389.99 mg/hg。本研究首次同時(shí)提取火龍果莖中的3種主要甾醇，為火龍果莖甾醇的進(jìn)一步研究開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論參考。

圖7 3種因素對(duì)綜合評(píng)分的響應(yīng)面圖