不同消毒劑及激素對黃果西番蓮莖段組織培養(yǎng)的影響①

黃東梅 吳 斌 馬伏寧 陳 弟 宋 順

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站/海南省香蕉遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南海口571101)

西番蓮（Passiflora edulisSims）又名百香果、熱情果（passion fruit），為熱帶、亞熱帶多年生半木質(zhì)藤本常綠果樹，原產(chǎn)澳大利亞和南美洲，目前在全球熱區(qū)有廣泛種植。中國西番蓮主栽品種有紫果種（P. edulis）、黃果種（P.edulisf.flavicarpa）、雜交種三大類。西番蓮果實(shí)香味多樣濃郁，且富含多種維生素、氨基酸及微量元素，風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益，適宜推廣種植［1-2]。目前影響西番蓮種植推廣的一個(gè)重要因素是健康無毒種苗的獲得。已發(fā)表的影響百香果的病毒記錄有近20 種，病毒潛伏期長，擴(kuò)散迅速，嚴(yán)重時(shí)可造成全株死亡甚至蔓延至整個(gè)果園，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，亟需開發(fā)完善的脫毒技術(shù)［3-4]。植物的組織培養(yǎng)具有繁殖系數(shù)大、周期短、去除病毒迅速等優(yōu)點(diǎn)，可作為脫毒技術(shù)的一個(gè)重要手段［5]。關(guān)于西番蓮組培技術(shù)目前有少量文獻(xiàn)報(bào)道，外植體一般選擇葉片［6-7]、莖段［8-9]、幼嫩卷須［10]和下胚軸［11]等，其中以莖段為材料報(bào)道最多。Prithviraj 等［7]以葉片為外植體，在MS＋6-BA 3.0 mg/L 培養(yǎng)基上分化率98%，增殖效率可達(dá)到100株/每外植體；張琴等［11]研究發(fā)現(xiàn)，以紫果西番蓮下胚軸的分化效率較子葉高，下胚軸在MS＋6-BA 3.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L 培養(yǎng)基上不定芽分化率最高；陳發(fā)興［12]以紫果西番蓮的葉盤、葉柄、莖段、卷須為外植體直接誘導(dǎo)不定芽結(jié)果表明，葉盤和卷須誘導(dǎo)不定芽比較困難，而葉柄相對容易，莖段在ZEA 達(dá)到2～3 mg/L 時(shí)，外植體萌芽率高達(dá)100%；Pipino 等［10]以西番蓮雜交品種“Guglielmo Betto” 幼嫩腋生卷須為外植體在MS基本培養(yǎng)基添加49.20 μmol/L 2-IP和2.68 μmol/L NAA 或4.43 μmol/L 6-BA 和11.41 μmol/L IAA 可直接分化出不定芽，其中前者芽分化率可達(dá)90%。西番蓮的組培技術(shù)還難以推廣應(yīng)用于種苗繁育，主要受限于基因型差異大、外植體的消毒難、增殖系數(shù)低、生根效率低等技術(shù)瓶頸。本研究對象為南美引進(jìn)試種成功的黃果西番蓮，該品種果皮黃色，果肉橙紅色，果型較現(xiàn)有主推品種大，果肉量多，酸甜比值優(yōu)異，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本試驗(yàn)擬對消毒劑、激素等影響黃果西番蓮莖段組培快繁的因素進(jìn)行研究，以保持母本的優(yōu)良性狀，為后期種質(zhì)保存及健康無毒種苗生產(chǎn)、種植和推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)以從南美引進(jìn)的在澄邁縣白蓮基地適應(yīng)性種植的黃果西番蓮（Passiflora edulisf.flavicarpa）為材料，選取一年生、生長健康的莖段。

1.2 方法

1.2.1 外植體的預(yù)處理及消毒

選取田間采集的莖段，流水沖洗表面，浸泡于0.2%高錳酸鉀溶液中進(jìn)行初步消毒處理，后扦插于水培培養(yǎng)基中，定期更換培養(yǎng)基［13]，培養(yǎng)一段時(shí)間后，選取新生的幼嫩莖段作為外植體。外植體的消毒首先用70%酒精消毒30 s，繼而選用0.1% HgCl2或2% NaClO 溶液消毒，處理時(shí)間包括10、15、20 min，后用無菌水沖洗3～5 次，用無菌濾紙將外植體表面的水吸干，接種至芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，以MS＋6-BA 1.0 mg/L＋I(xiàn)AA 1.0 mg/L 為基本芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，試驗(yàn)采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理組合10 個(gè)外植體，重復(fù)3 次。觀察外植體污染及生長情況并記錄，根據(jù)結(jié)果篩選合適的消毒藥劑和消毒時(shí)間。

污染率＝（污染外植體總數(shù)/外植體總數(shù)）×100%

未污染存活率＝（未污染且外植體接種10 d后仍保持綠色外植體數(shù)/未污染外植體總數(shù)）×100%。

1.2.2 不同激素濃度對西番蓮莖段芽誘導(dǎo)的影響

激素選用細(xì)胞分裂素6-BA（1.0、2.0、3.0 mg/L） 和 生 長 素IAA （1.0、2.0 mg/L） 或NAA（0.1、0.3 mg/L）接種表面消毒處理好的外植體，完全隨機(jī)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共12 個(gè)處理組合，每個(gè)處理組合9 個(gè)外植體，重復(fù)3 次。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果篩選最優(yōu)化的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.3 不同激素濃度對生根誘導(dǎo)的影響

再生芽經(jīng)過增殖壯苗長至2～3 cm 后，將芽切下，轉(zhuǎn)至添加IBA（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）的1/2 MS 培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)，每個(gè)處理接種3瓶，每瓶接1 株，重復(fù)3 次，觀察并統(tǒng)計(jì)生根情況，篩選最佳生根培養(yǎng)基。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同處理之間采用LSD 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理污染情況

隨著消毒時(shí)間的增加，污染率呈下降的趨勢，未污染存活率呈平穩(wěn)后下降的趨勢，表明消毒處理時(shí)間越長消毒越徹底但同時(shí)外植體越容易受消毒液毒害，0.1% HgCl2的消毒效果好于2% NaClO（表1）。選擇污染率低且外植體存活率高的組合為最優(yōu)化的消毒處理方法，即0.1% HgCl2處理15 min。

表1 不同消毒處理對西番蓮莖段芽誘導(dǎo)的影響

2.2 不同激素對芽誘導(dǎo)的影響

外植體在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上受細(xì)胞分裂素和生長素的綜合影響，培養(yǎng)一周左右逐漸膨大，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推進(jìn)，有在莖段節(jié)點(diǎn)冒出數(shù)個(gè)芽點(diǎn)，也有僅莖段膨大在切口處長出新生細(xì)胞堆積形成瘤狀愈傷組織的，不同培養(yǎng)及配方的出芽率和形態(tài)均有差別。外植體在6-BA＋I(xiàn)AA組合的培養(yǎng)基芽誘導(dǎo)率較MS＋6-BA＋NAA高一些（表2）。外植體在6-BA＋I(xiàn)AA 組合培養(yǎng)基里誘導(dǎo)的叢生芽呈現(xiàn)綠色，芽點(diǎn)較多，而6-BA＋NAA組合培養(yǎng)基里的外植體長出的叢生芽芽點(diǎn)較少，在莖段上長出一點(diǎn)一點(diǎn)白色蓬松的愈傷組織。故6-BA＋I(xiàn)AA更適合用于黃果西番蓮莖段再生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)，以MS＋6-BA 2.0 mg/L＋I(xiàn)AA 1.0 mg/L中芽誘導(dǎo)率最高。

2.3 不同激素濃度對生根的影響

不定芽接種在生根培養(yǎng)基后，基部逐漸膨大并長出根原基，隨后根毛逐漸伸長，形成根系良好的完整植株。黃果西番蓮的不定芽在添加或無添加IBA 的培養(yǎng)基上均能生根，但在添加IBA 的培養(yǎng)基上生根效果較好，不同IBA濃度對生根誘導(dǎo)影響結(jié)果（表3），以MS＋I(xiàn)BA 0.5～1.0 mg/L培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根最好。黃果西番蓮莖段組培過程（圖1）。

表2 不同激素濃度對西番蓮莖段再生芽誘導(dǎo)的影響

表3 不同激素濃度對西番蓮再生芽生根誘導(dǎo)的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

植物組織培養(yǎng)中，對田間取材的植物材料進(jìn)行預(yù)處理很有必要，田間復(fù)雜的環(huán)境導(dǎo)致病蟲害較多，且西番蓮的匍匐莖是中空的，難以消毒干凈。外植體消毒是組織培養(yǎng)繁殖方式最重要的環(huán)節(jié)之一，通常消毒劑對植物材料都具有毒害作用，且對環(huán)境的污染也比較嚴(yán)重［14]，因此選擇適當(dāng)?shù)南緞┓N類和處理時(shí)間非常關(guān)鍵。李紅艷［15]在不同滅菌劑對紫果西番蓮莖段無菌芽誘導(dǎo)的影響進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，雙因子HgCl210 min＋NaClO 10 min是最佳的滅菌處理組合。本試驗(yàn)選取田間采集的一年生黃果西番蓮健康莖段進(jìn)行初步消毒、水培扦插后新生的幼嫩腋芽及莖段作為外植體，比直接從田間采集的幼嫩腋芽和莖段更少接觸病蟲害，在相同消毒處理下有助于降低污染率。此外，在提高消毒時(shí)間追求低污染率的同時(shí)還要兼顧未污染外植體的存活率方有實(shí)際意義。在本研究中對兩者數(shù)據(jù)均作了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示0.1%HgCl2消毒15 min，污染率為26.7%，未污染存活率為95.2%，為優(yōu)化的消毒處理方法。

圖1 黃果西番蓮莖段組織培養(yǎng)

在前人對西番蓮莖段組培的研究中，Costa等［9]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的細(xì)胞分裂素適合黃果西番蓮莖段外植體芽的增殖和葉的發(fā)育，細(xì)胞分裂素和生長素不利于根系的分化和生長；楊冬業(yè)等［8]以西番蓮莖段為外植體，在MS＋6-BA2.0mg/L上叢生芽誘導(dǎo)率達(dá)100%；史沉魚等［16]認(rèn)為，最佳叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L＋土豆泥200 mg/L；孫琪等［17]以西番蓮當(dāng)年生幼嫩莖段為材料在MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.05 mg/L IAA 中芽誘導(dǎo)率最高。本試驗(yàn)選用6-BA 和IAA、NAA 激素組合進(jìn)行對比試驗(yàn)，結(jié)果為黃果西番蓮幼嫩腋芽和莖段在MS＋6-BA＋I(xiàn)AA 組合的培養(yǎng)基上芽誘導(dǎo)效果較好，與孫琪等［17]研究結(jié)果相似。

生根培養(yǎng)方面，外源的生長素可以有效的刺激細(xì)胞的分裂和根原基的形成，促進(jìn)生根誘導(dǎo)和伸長，組培中最常用的生根劑為IBA 和NAA。史沉魚等［16]研究結(jié)果表明，紫果西番蓮再生芽的最佳生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+IBA 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L＋活性炭2.0 g/L；Prithviraj 等［7]發(fā)現(xiàn)，黃果西番蓮再生芽在1/2 MS＋I(xiàn)BA 0.5～1.0 mg/L 生根效果好，生根率達(dá)96%以上。本研究結(jié)果與Prithvi‐raj 等［7]研究結(jié)果一致。

3.2 結(jié)論

本試驗(yàn)以南美引進(jìn)黃果西番蓮一年生健康莖段經(jīng)過預(yù)處理后水培扦插長出的腋芽和幼嫩莖段為外植體，對外植體的消毒試劑及時(shí)間、芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素及濃度、生根培養(yǎng)基的激素濃度進(jìn)行優(yōu)化篩選。結(jié)果表明：經(jīng)過預(yù)處理水培扦插后的外植體經(jīng)過0.1%升汞處理15 min 后污染率最低且未污染成活率最高；外植體在MS＋6-BA 2.0 mg/L＋I(xiàn)AA 1.0 mg/L 上芽誘導(dǎo)率最高，為96.3%；不定芽在1/2 MS＋I(xiàn)BA 0.5～1.0 mg/L 培養(yǎng)基上生根效果最好，生根誘導(dǎo)率最高可達(dá)100%。

本研究獲得了一套適宜南美引進(jìn)黃果西番蓮的組培快繁方法，可應(yīng)用于母本資源保存和種苗繁育。