調(diào)控自噬在臨床肝病治療性應(yīng)用的轉(zhuǎn)化研究

汪艷

作者單位：510515 廣州 器官衰竭防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省肝纖維化工程技術(shù)研究中心，南方醫(yī)科大學(xué)肝病研究所

自噬是真核細(xì)胞的一種進(jìn)化保守的分解途徑，始于細(xì)胞器吞噬，終于溶酶體。自噬對維持器官穩(wěn)態(tài)有重要作用，參與抗衰老和免疫反應(yīng)等機(jī)制[1]。很多疾病存在自噬異常，如肥胖、2型糖尿病、炎癥和感染性疾病、神經(jīng)退行性病變以及腫瘤等[2]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的自噬作用主要有三種：大自噬、小自噬以及分子伴侶介導(dǎo)自噬。一些非經(jīng)典自噬也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。本文內(nèi)容主要涉及大自噬(以下稱為自噬)。

一、自噬的基本分子過程和生理功能

自噬始于自噬小體形成。自噬小體形成過程中，部分細(xì)胞質(zhì)(其中也許有細(xì)胞器、蛋白聚合體、脂滴等)成批或選擇性地被捕獲。選擇性捕獲的自噬有多種，如線粒體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬、外來入侵微生物異物自噬。發(fā)生選擇性自噬時(shí)，自噬適配分子會(huì)專門將吞噬對象靶向運(yùn)送到自噬小體的囊膜上，發(fā)生泛素依賴或非依賴性的捕獲作用。然后，自噬小體沿著微管運(yùn)輸吞噬物至溶酶體進(jìn)行降解。自噬作用依賴自噬相關(guān)基因(ATG)蛋白和由第三類磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3P)、Beclin-1以及ATG14L組成的復(fù)合物的活性。這個(gè)復(fù)合物可以產(chǎn)生PI3P，PI3P是自噬小體形成所需的。自噬小體成熟為自噬溶酶體還要依賴某些ATG蛋白分子、Rab GTP酶的活性、系連分子和適配分子，以及SNARE分子等完成融合過程。

在肝細(xì)胞中，自噬作為對饑餓的反應(yīng)，通過溶酶體降解自噬物，會(huì)形成氨基酸、碳水化合物以及脂肪酸再循環(huán)入胞質(zhì)。自噬可以去除錯(cuò)位折疊蛋白和受損細(xì)胞器，協(xié)助胞質(zhì)質(zhì)量控制，維持肝組織穩(wěn)態(tài)。自噬還有脂質(zhì)吞噬作用，參與脂質(zhì)代謝。

二、自噬對肝臟疾病的干預(yù)策略和干預(yù)方式

涉及治療肝病的干預(yù)策略可以從三方面考慮：首先，自噬基因和溶酶體分子表達(dá)的上游轉(zhuǎn)錄因子；其次自噬小體形成起始階段的吞噬泡聚集(或膜分離)、延伸和成熟，以及自噬小體閉合等環(huán)節(jié)；最后成熟階段的自噬小體與內(nèi)溶酶體囊腔融合，溶酶體水解酶的活性，以及營養(yǎng)物從溶酶體循環(huán)至胞質(zhì)等環(huán)節(jié)。

干預(yù)方式可以采?。?1)遺傳性干預(yù)，如選擇性過表達(dá)某些ATG蛋白、轉(zhuǎn)錄因子TFEB調(diào)控自噬和溶酶體生成；(2)藥物干預(yù)，包括使用自噬抑制劑如3-甲基腺嘌呤(3-MA)，ATG活性特異性抑制劑如ULK1或ATG4B，TFEB激活劑如ezetimibe，以及目前最廣泛用于以調(diào)控自噬為目的的臨床研究的雷帕霉素及類似物和氯喹及其衍生物；(3)營養(yǎng)性干預(yù)，如限制熱量攝入，或者增加自然來源營養(yǎng)物質(zhì)激活自噬；(4)多通路干預(yù)，即聯(lián)合應(yīng)用以上干預(yù)方式。

三、臨床肝病治療的應(yīng)用分析

(一)急性肝衰竭(ALF)

喪失自噬作用會(huì)在動(dòng)物模型誘發(fā)自發(fā)性肝腫大和肝損傷。通過使用自噬激活劑或誘導(dǎo)ATG5表達(dá)，這些變化可以恢復(fù)。自噬在應(yīng)激性肝損傷中有限制肝細(xì)胞死亡的作用。

1．對乙酰氨基酚(APAP)過量 APAP過量是ALF常見原因。APAP過量會(huì)引起肝細(xì)胞自噬增加，以清除受損線粒體。雷帕霉素激活自噬，有一定保護(hù)作用，而使用氯喹或者去除ATG7阻止自噬會(huì)加重肝損傷。自噬保護(hù)作用還有賴于APAP蛋白質(zhì)胼合物形成。無菌性炎癥由炎癥小體依賴性IL-1β釋放介導(dǎo)，也參與了APAP肝損傷。線粒體損傷可能是炎癥小體激活的原因。自噬去除受損線粒體有助于避免炎癥小體過度活化。

2．死亡受體介導(dǎo)肝損傷 死亡受體介導(dǎo)肝損傷常見于病毒性肝炎、急性酒精性肝炎以及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。自噬的保護(hù)作用包括：自噬可以直接抑制肝細(xì)胞中caspase 8；巨噬細(xì)胞中發(fā)生p62依賴性線粒體自噬可以限制NF-κB介導(dǎo)炎癥和炎癥小體依賴性IL-1β的產(chǎn)生。

3．缺血再灌注(I/R)肝損傷 隨缺血類型(熱、冷)、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以及所用保存液類型等的不同，自噬在I/R損傷中的作用有不同報(bào)道。而且還沒有評價(jià)體內(nèi)自噬作用的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。

4．轉(zhuǎn)化策略 實(shí)驗(yàn)研究顯示自噬有肝保護(hù)和抗炎作用，提示使用自噬活化劑藥物可能是一種治療策略，尤其在APAP肝損傷的情況下，但是否可用于I/R損傷還需要更多研究。

(二)遺傳性肝病

1．Wilson’s病(WD) 自噬可以對抗WD引起的銅毒性。在WD患者肝臟、ATP7/B缺陷的小鼠模型，以及沉默了ATP7B并暴露于CuCl2的肝細(xì)胞株，自噬會(huì)增加。用自噬特異性抑制劑spautin-1阻斷自噬，會(huì)加重體外和體內(nèi)模型肝細(xì)胞死亡、線粒體損傷和氧化應(yīng)激。而如果通過饑餓或過表達(dá)TEFB激活自噬，則可以促進(jìn)肝細(xì)胞存活。能否使用自噬活化劑對抗WD銅毒性還需要繼續(xù)探索。這一作用能否擴(kuò)展到其他金屬相關(guān)肝病，如血色素沉著病也值得觀察。

2．α-1抗胰蛋白酶(α1-AT)缺陷病α1-AT 缺陷患者會(huì)出現(xiàn)含ATZ自噬小體聚集增多。ATG5敲除細(xì)胞表現(xiàn)出ATZ降解遲緩。提示自噬對降解ATZ有重要作用。然而僅降解還不足夠，相當(dāng)部分ATZ頑固地存留在包涵體里，對肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性，引起肝損傷和肝纖維化。幾項(xiàng)臨床前研究顯示，誘導(dǎo)自噬可以改善α1-AT 缺陷引起的肝損傷和纖維化。肝細(xì)胞TFEB轉(zhuǎn)基因治療α1-AT 缺陷小鼠模型，可以明顯減少肝臟中ATZ、肝細(xì)胞凋亡和纖維化。用卡馬西平活化自噬也出現(xiàn)類似效果。雷帕霉素或熊去氧膽酸也顯示有益作用。一項(xiàng)II期臨床試驗(yàn)成人α1-AT 缺陷相關(guān)肝硬化患者正在進(jìn)行使用卡馬西平 52周治療觀察(NCT01379469)。

對毒性蛋白或金屬在胞內(nèi)過度聚集引起的病變，活化自噬也許是一個(gè)可以考慮的治療策略。

(三)非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)

自噬通過脂質(zhì)吞噬可以對抗肝細(xì)胞脂肪變，通過肝細(xì)胞的線粒體自噬和巨噬細(xì)胞的抗炎作用具有護(hù)肝作用，從而緩解肝病進(jìn)展。

自噬受到NAFLD相關(guān)多種病理因素影響而減弱。在NAFLD動(dòng)物模型和患者中都發(fā)現(xiàn)自噬水平是降低的。在NASH患者和小鼠，ATG蛋白和TFEB表達(dá)下降，而p62和自噬抑制分子Rubicon的表達(dá)則升高。與NAFL和肝臟正常者相比，NASH患者肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的自噬水平下降。如小鼠肝臟細(xì)胞中自噬通路的相關(guān)分子被敲除，或者將小鼠暴露于3-MA，給予高脂飲食飼養(yǎng)會(huì)引發(fā)小鼠嚴(yán)重NAFLD。表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變和Mallory-Denk小體增多，肝細(xì)胞損傷加重，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎性因子生成增加。相反，如敲除自噬抑制分子Rubicon或腺病毒轉(zhuǎn)染ATG7，小鼠模型的脂肪變和肝損傷改善。近期數(shù)據(jù)顯示，線粒體自噬受損也參與形成NAFLD肝損傷，以及形成巨大線粒體。但是，自噬通路成分對肝細(xì)胞脂肪變形成的確切作用目前還有爭議。

NAFLD治療目前仍以干預(yù)生活方式為主，包括控制飲食和改變體力活動(dòng)。限制熱量攝入和運(yùn)動(dòng)也是兩種重要的自噬活化方式。用二甲雙胍或二糖四已聚糖靶向AMPK，或使用咖啡因增強(qiáng)脂質(zhì)自噬和β-氧化作用，也顯示抗脂質(zhì)生成作用。另外，使用TFEB激動(dòng)劑或肝細(xì)胞TFEB過表達(dá)，在高脂飲食小鼠模型可以通過自噬對抗脂肪變發(fā)生。地高辛、斑霉素和己聯(lián)雙辛胍可以促進(jìn)TFEB入核，活化自噬，改善高脂飲食小鼠模型脂質(zhì)代謝、胰島素耐受和脂肪變。最近還發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞TFEB過表達(dá)可以誘導(dǎo)自噬、降低IL-1β生成。因此可以繼續(xù)觀察TFEB激動(dòng)劑是否減輕NASH進(jìn)展相關(guān)的炎癥反應(yīng)。TFEB激動(dòng)劑ezetimibe是NPC1L1依賴性膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑。使用ezetimide和四已聚糖可以抑制巨噬細(xì)胞中NRLP3-依賴的IL-1β生成。ezetimide可以減輕NASH損傷，四已聚糖則在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ捅憩F(xiàn)出血管保護(hù)作用。值得一提的是這些都是FDA已經(jīng)獲批的藥物，ezetimide已經(jīng)開始用于NASH臨床試驗(yàn)。

NAFLD會(huì)發(fā)生自噬失調(diào)。靶向自噬似乎有治療前景。值得注意的是，相關(guān)藥物的作用是否完全是因自噬相關(guān)作用引起尚需要闡明。有必要進(jìn)一步研發(fā)具有自噬特異性的治療藥物。

(四)肝纖維化

自噬對纖維化的作用比較復(fù)雜，依賴于細(xì)胞類型。

1．星狀細(xì)胞(HSC) 活化HSC的自噬會(huì)增加。自噬在HSC向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程發(fā)揮了重要作用。自噬促進(jìn)了靜止?fàn)顟B(tài)HSC中脂滴消化，自噬促進(jìn)脂酶代謝視黃酯為游離脂肪酸，進(jìn)行線粒體β-氧化，增加ATP水平。敲除HSC的ATG5或ATG7，可以對CCl4和TAA誘導(dǎo)肝纖維化有抵抗作用，HSC活化水平也會(huì)降低。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激等通過增加自噬、活化HSC，導(dǎo)致纖維化加重。此外，自噬底物p62下調(diào)可能是HSC活化的另一機(jī)制。敲除HSC的p62會(huì)加劇α-SMA和COL1A1的表達(dá)。與野生型小鼠相比，HSC特異性敲除p62的小鼠模型更容易發(fā)生纖維化。

2．肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞 肝細(xì)胞凋亡是啟動(dòng)和維持纖維化發(fā)生過程的中心事件。自噬可以為肝細(xì)胞提供生存信號(hào)，可以被看作抗纖維化作用。老年小鼠敲除肝臟ATG會(huì)發(fā)生自發(fā)肝纖維化，這是由于蛋白毒性和促/抗凋亡蛋白穩(wěn)態(tài)被擾亂而造成的。選擇性干擾ATG或ATG7會(huì)破壞內(nèi)皮細(xì)胞表型，當(dāng)給予小鼠CCl4或持續(xù)高脂飲食易引發(fā)肝損傷、炎癥和纖維化。

3．巨噬細(xì)胞 在各種來源巨噬細(xì)胞，自噬可以降低IL-1β生成，阻礙HSC的存活和促纖維化作用通路，可以被看作抗炎作用。ATG敲除的庫普弗細(xì)胞與HSC共培養(yǎng)可以增加HSC的纖維化發(fā)生能力。使用IL-IR抗體可減弱這個(gè)作用。較野生型小鼠，髓樣細(xì)胞系缺失ATG5小鼠，肝IL-1β表達(dá)會(huì)增加，也更容易發(fā)生肝損傷和纖維化。靶向自噬應(yīng)考慮針對專有細(xì)胞類型。

(五)肝細(xì)胞癌(HCC)

HCC產(chǎn)生于多種信號(hào)通路的體細(xì)胞突變組合。自噬與這些通路相互作用，對HCC發(fā)生、發(fā)展有雙向影響。

1．自噬阻止HCC發(fā)生 自噬維護(hù)細(xì)胞內(nèi)部穩(wěn)態(tài)，抵御腫瘤發(fā)生。去除Beclin-1、ATG5或ATG7破壞自噬，可以促進(jìn)年老小鼠自發(fā)肝腫瘤，還會(huì)引起p62聚集。p62聚集一方面通過結(jié)合KEAP1阻止NRF2的抗氧化作用，另一方面通過與NF-κB、PI3K/Akt/mTOR和/或Wnt-β-catenin對話促進(jìn)腫瘤發(fā)生。Yap過表達(dá)參與了肝癌發(fā)生的早期事件，自噬會(huì)增加Yap降解。

2．自噬促進(jìn)HCC進(jìn)展 自噬在已經(jīng)形成的HCC中是增加的。腫瘤細(xì)胞通過自噬獲得更多能量，提高在低氧、低營養(yǎng)環(huán)境條件下的生存能力。自噬還可以通過促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，使腫瘤細(xì)胞獲得侵蝕能力。自噬分子LC3和Beclin-1在多項(xiàng)研究中被發(fā)現(xiàn)有預(yù)后意義。

至今還沒有聯(lián)合傳統(tǒng)HCC治療進(jìn)行自噬調(diào)節(jié)的臨床數(shù)據(jù)。但是臨床前研究顯示，自噬有治療靶標(biāo)的潛力，如靶向殘余腫瘤細(xì)胞抑制自噬可能有助于治療，聯(lián)合使用自噬抑制劑可以提高腫瘤對sorafenib的治療反應(yīng)。然而產(chǎn)生有效的抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)需要自噬，將自噬活化劑聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑也許可以激發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)。

(六)酒精性肝病(ALD)

自噬參與ALD的情況比較復(fù)雜，在急性飲酒與慢性飲酒的數(shù)據(jù)有所不同。

1．急性飲酒急性飲酒時(shí)，乙醇會(huì)導(dǎo)致過氧化物產(chǎn)生增加、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、脂質(zhì)生成和線粒體改變。乙醇還可以抑制mTOR1復(fù)合物，引起ULK1活化，增加FoxO3a核轉(zhuǎn)移，從而提高很多自噬相關(guān)基因的表達(dá)。急性飲酒還會(huì)提高TFEB的核內(nèi)水平。由此，自噬對急性飲酒是肝保護(hù)性的，它通過降解受損線粒體和脂滴，減少肝細(xì)胞凋亡和脂肪變。

2．慢性飲酒 慢性酒精飼養(yǎng)的小鼠模型肝臟中自噬小體數(shù)量增加，然而溶酶體數(shù)量卻因乙醇作用而下降，這影響到自噬動(dòng)態(tài)變化。溶酶體數(shù)量衰減與TFEB核聚集減少以及溶酶體功能受損相關(guān)。過表達(dá)TFEB可以逆轉(zhuǎn)酒精對溶酶體生成的破壞作用，小鼠對脂肪變和肝損傷的抵御能力相應(yīng)增加。另一種可能機(jī)制是sGTP Rab7失活和dynamin2活性降低，造成溶酶體耗竭和脂質(zhì)吞噬抑制。

臨床前數(shù)據(jù)顯示，使用卡馬西平或雷帕霉素提高自噬，可以減輕ALD小鼠模型的肝脂肪變和肝損傷。由于NASH和ALD共有一些病理特點(diǎn)，有可能在NASH驗(yàn)證有效的自噬靶向治療在ALD也可以進(jìn)行評價(jià)。

四、應(yīng)用轉(zhuǎn)化研究的挑戰(zhàn)

為進(jìn)一步開展臨床試驗(yàn)、廣泛測試自噬調(diào)控作用，有幾點(diǎn)需要引起注意[3]。首先，進(jìn)一步分析肝病自噬調(diào)節(jié)通路的特點(diǎn)，對尋找可靶向的自噬特異性調(diào)控環(huán)節(jié)是必要的。第二，尋找自噬標(biāo)志物和測量體內(nèi)自噬動(dòng)態(tài)變化的方法，對于開發(fā)自噬靶向策略非常重要，而且還要考慮到疾病特異性。第三，尋找慢性肝病的最佳治療時(shí)間窗也是必須的，因?yàn)樵诟尾〔煌M(jìn)展階段，自噬的類型和程度可能也有變化。第四，技術(shù)策略最好是特異靶向某種細(xì)胞，減少對其他細(xì)胞的影響。最后，使用量和頻次需要仔細(xì)界定，因?yàn)檫^度活化自噬可能是破壞性的，自噬調(diào)節(jié)劑的治療效果可能也只有通過間歇治療達(dá)到。而且肝臟自噬存在晝夜節(jié)律現(xiàn)象，應(yīng)該作為優(yōu)化治療的一個(gè)考慮因素。