生物傳感細(xì)胞ADP1_pWHlux表征水中污染物急性毒性的實驗設(shè)計

張 凱, 陳 健, 賈建麗

(1. 中國礦業(yè)大學(xué)(北京) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院, 北京 100083;2. 中國礦業(yè)大學(xué)(北京) 地球科學(xué)預(yù)測繪工程學(xué)院, 北京 100083)

人類向環(huán)境排放的大量污染物長期在水環(huán)境中暴露和積累,其中不乏具有急性毒性的物質(zhì)[1-4]。目前國際公認(rèn)的對水中急性毒性的生物測定方法主要是通過藻類(大型藻)及淡水魚(斑馬魚)兩類標(biāo)準(zhǔn)生物法,但是操作過程復(fù)雜、漫長,難以廣泛應(yīng)用。近年來,通過基因工程改造而構(gòu)建的生物傳感細(xì)胞在檢測水環(huán)境的急性毒性物質(zhì)應(yīng)用越來越引起研究人員的興趣[5-6]。毒性物質(zhì)通過阻礙細(xì)菌新陳代謝,進(jìn)而抑制發(fā)光基因的表達(dá),因此可通過細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度測定水環(huán)境中急性毒性物質(zhì)[7]。生物傳感細(xì)胞檢測水環(huán)境中急性毒性物質(zhì)較傳統(tǒng)方法具有響應(yīng)速度快,操作步驟簡單,靈敏度高,成本低等優(yōu)點[8]。

當(dāng)前,國內(nèi)高校本科生環(huán)境監(jiān)測、環(huán)境生物學(xué)等教學(xué)實驗普遍是以污染物定量測定為主的經(jīng)典國標(biāo)法理化表征實驗,實驗內(nèi)容比較陳舊,很難激發(fā)學(xué)生對實驗課的興趣,因此有必要設(shè)置一些學(xué)科前沿的實驗課程[9-11]。利用發(fā)光菌毒性快速檢測水體污染物的實驗探索[12]，重金屬Zn、Cu和Hg對重組發(fā)光細(xì)菌的影響[13],重組發(fā)光細(xì)菌應(yīng)用于重金屬檢測技術(shù)研究[14]，BODIPY基熒光探針對銅離子檢測[15]等實驗雖然開展豐富了環(huán)境科學(xué)與環(huán)境工程學(xué)科的實驗教學(xué)內(nèi)容,但也存在一些如實驗成本過高、實驗步驟繁瑣等不利于推廣的問題。本實驗采用的原料均廉價易得,實驗用材料可自行培養(yǎng)獲得,對實驗條件要求不高,便于推廣。因此,期望本實驗的開展能夠為環(huán)境科學(xué)與環(huán)境工程學(xué)科專業(yè)實驗有所助益。

1 實驗材料與設(shè)備

實驗材料：急性毒性檢測的生物傳感細(xì)胞(ADP1_pWHlux)，HgCl2溶液，無菌去離子水。

主要設(shè)備：棕色瓶、移液器、酶標(biāo)儀LB 962(Berthold,USA)與黑色底透96孔酶標(biāo)板(Grenier,Germany)配合使用，計時器。

2 實驗前準(zhǔn)備

2.1 ADP1_pWHlux的培養(yǎng)

(1) 含200 μg/mL 氨芐青霉素的LBA(LBA_ amp200)固體培養(yǎng)基用于培養(yǎng)并保存ADP1_pWHlux菌株,平板培養(yǎng)皿保存溫度4 °C,保存時間1個月,超過1個月要重新接種。使用時從平板培養(yǎng)皿中挑取ADP1_pWHlux單菌落接種到有5 mL LB_amp200的滅菌50 mL塑料離心管中,于30 °C、150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中過夜(16 h)培養(yǎng),為保證傳感細(xì)胞生長良好,測其OD600值須在0.4以上(如不符合要求,則重新接種培養(yǎng)),記為菌液A。菌液A保存于4 ℃冰箱,超過7 d時棄掉,重新從平板上接種培養(yǎng)。

(2) 取200 μL菌液A接種到約5 mL LB_amp200中,于30 ℃、150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng),測其OD600值,須在0.5～0.6(如不符合要求,則重新接種培養(yǎng)),記為菌液B。菌液B每次使用都需要重新接種。

(3) 將菌液B在6 000 r/min條件下離心10 min,收集菌體,棄上清,加入與離心前等量的LB重懸菌體(用移液器充分吹打重懸)。按照所設(shè)稀釋比(此前實驗驗證1∶10為最佳稀釋比)用LB培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋,所得稀釋后的ADP1_pWHlux菌液用于檢測急性毒性。

2.2 污水水樣的采集

選取靠近上清橋的清河的某排污口處、下游及上游3點各取500 mL的水樣,分別記為A1、A2、A3,其中A2距排污口20 m,A3距排污口30 m,水樣采集點距河岸5 m。

2.3 實驗知識準(zhǔn)備

實驗課上,教師講解在急性毒性物質(zhì)作用下生物傳感細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度變化的原理,講解酶標(biāo)儀的原理(見圖1)、基本構(gòu)成以及使用方法(參照多功能讀板機(jī)_BERTHOLD_LB9462操作流程),并完成實驗設(shè)計的理論。

圖1 酶標(biāo)儀工作原理圖

閱讀參考文獻(xiàn)[9-10],掌握發(fā)光細(xì)菌在測定水質(zhì)綜合毒性的研究進(jìn)展、生物傳感細(xì)胞的構(gòu)建及其在急性毒性物質(zhì)誘導(dǎo)下,基因表達(dá)方式及對發(fā)光強(qiáng)度的影響原理。生物傳感細(xì)胞(ADP1_pWHlux)主要具有啟動基因和報道基因相互耦合的結(jié)構(gòu),當(dāng)啟動基因為組成型表達(dá)時,毒性物質(zhì)會抑制報道基因轉(zhuǎn)錄和翻譯,通過檢測報道產(chǎn)物的量的減少即可表征毒性的強(qiáng)度。利用生物傳感細(xì)胞進(jìn)行急性毒性測定主要是基于非特異型傳感細(xì)胞應(yīng)答機(jī)制,有毒物質(zhì)通過阻礙細(xì)菌新陳代謝,抑制發(fā)光基因的表達(dá),因此細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度與毒性物質(zhì)濃度成負(fù)相關(guān)(Light-off效應(yīng))(見圖 2)。

圖2 非特異型生物傳感細(xì)胞毒性檢測應(yīng)答機(jī)制

閱讀文獻(xiàn)[13],了解不同濃度的HgCl2及其他水環(huán)境中優(yōu)先污染物(如 Be2+、Ba2+、Cu2+等)對 ADP1_pWHlux 發(fā)光強(qiáng)度的影響,初步掌握ADP1_pWHlux對水環(huán)境中急性毒性物質(zhì)的檢測。

3 實驗

3.1 ADP1_pWHlux對HgCl2的響應(yīng)

參照GB/T 15441—1995國家標(biāo)準(zhǔn),本實驗取HgCl2作為急性毒性檢測的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),分別稀釋至質(zhì)量濃度為0.4、1、2、3、4 mg/L,保存于30 mL棕色細(xì)口瓶中。分別在酶標(biāo)板微孔內(nèi)加入菌液100 μL ,取 100 μL 上述不同質(zhì)量濃度 HgCl2加入酶標(biāo)板各孔中,無菌去離子水作為陰性對照,共設(shè)置3個平行實驗。酶標(biāo)儀設(shè)置參數(shù)：每5 min讀取每個酶標(biāo)板微孔的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值,共連續(xù)測定2 h。

根據(jù)每5 min測定的發(fā)光強(qiáng)度數(shù)值,繪制出ADP1_pWHlux在不同濃度HgCl2誘導(dǎo)下發(fā)光強(qiáng)度隨時間的變化曲線。

3.2 ADP1_pWHlux對待測水樣的測定

取100 μL待測水樣和100 μL菌液混合,設(shè)置3個平行實驗。在室溫下,置于酶標(biāo)儀中60min時測量其發(fā)光強(qiáng)度值。

計算出待測水樣與 ADP1_pWHlux 混合 60 min 時的發(fā)光抑制率,并和標(biāo)準(zhǔn)的HgCl2溶液誘導(dǎo)下的發(fā)光抑制率相比較,快速表征水體的急性毒性程度。

3.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗都設(shè)置3個平行組,分別計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差及發(fā)光抑制率。發(fā)光抑制率計算如下式：

發(fā)光抑制率=

上式反映待測水樣中可被生物傳感細(xì)胞有效利用部分的急性毒性水平。細(xì)胞對某種物質(zhì)急性毒性的檢出限定義為暴露于該質(zhì)量濃度污染物60 min后,細(xì)胞發(fā)光明顯低于陰性對照的質(zhì)量濃度(P<0.05)[16]。發(fā)光抑制率越高,表明待測樣品急性毒性越強(qiáng),不具急性毒性的樣品理論發(fā)光抑制率為0；在毒性水平相同條件下,發(fā)光抑制率越高,則說明傳感細(xì)胞越靈敏。

4 實驗結(jié)果

4.1 ADP1_pWHlux對HgCl2響應(yīng)曲線繪制

ADP1_pWHlux分別在不同濃度的HgCl2誘導(dǎo)下,其發(fā)光強(qiáng)度隨時間的變化見圖3。由圖3可知,當(dāng)HgCl2的濃度高于0.4 mg/L時,ADP1_pWHlux的發(fā)光強(qiáng)度明顯降低,其對急性毒性物質(zhì)產(chǎn)生響應(yīng)。4 mg/L 的HgCl2迅速對ADP1_pWHlux發(fā)光產(chǎn)生抑制,5 min時就可將發(fā)光強(qiáng)度降至初始的50%以下；誘導(dǎo)時間在100 min時,發(fā)光強(qiáng)度基本降至為0。大量實驗結(jié)果表明,ADP1_pWHlux的發(fā)光強(qiáng)度在0.4～4.0 mg/L的HgCl2誘導(dǎo)60 min變化已較為明顯,HgCl2濃度越高,其對ADP1_pWHlux的發(fā)光抑制越明顯。為了簡化檢測水體急性毒性物質(zhì)的步驟,快速得到結(jié)果,可直接讀取誘導(dǎo)60 min時的發(fā)光強(qiáng)度值。

圖3 不同濃度 HgCl2 對 ADP1_pWHlux 發(fā)光強(qiáng)度的影響

4.2 待測水樣的急性毒性表征結(jié)果

ADP1_pWHlux 與待測水樣混合至60 min 時讀取發(fā)光強(qiáng)度值,并計算出發(fā)光抑制率,并與在0.4～2.0 mg/L的HgCl2誘導(dǎo)下ADP1_pWHlux的發(fā)光抑制率相比較,結(jié)果如圖4所示。由圖可知,在清河所取的3個水樣的急性毒性大小順序：0.4 mg/L HgCl2急性毒性

圖4 ADP1_pWHlux對污染水樣的檢測(誘導(dǎo)60min)

5 結(jié)語

生物傳感細(xì)胞ADP1_pWHlux表征污水急性毒性在環(huán)境檢測、污染物毒性評估等諸多領(lǐng)域獲得了高度的關(guān)注與應(yīng)用,研究進(jìn)展突飛猛進(jìn)。通過本實驗,不僅可以鍛煉學(xué)生的基本實驗操作技能,還可以加深學(xué)生對環(huán)境生物檢測前沿技術(shù)的理解,激發(fā)學(xué)生的專業(yè)興趣和對科學(xué)的探索與研究。本實驗應(yīng)用在我校環(huán)境科學(xué)與工程專業(yè)本科生專業(yè)實驗課程中取得了良好的教學(xué)效果,因此建議在環(huán)境領(lǐng)域相關(guān)學(xué)科中廣泛推廣。