黃芪多糖聯(lián)合二甲雙胍對(duì)衰老2型糖尿病模型小鼠肝臟糖脂代謝的影響

李丹丹 劉佳佳 吳玉泓 李海龍 王勇 陳徹 王晶

摘要：目的? 觀察黃芪多糖聯(lián)合二甲雙胍對(duì)衰老2型糖尿病模型小鼠肝臟糖脂代謝的影響，探討其作用機(jī)制。方法? 采用高糖高脂飼料聯(lián)合鏈脲佐菌素誘導(dǎo)自然衰老小鼠制作衰老2型糖尿病小鼠模型。實(shí)驗(yàn)小鼠分為衰老對(duì)照組、衰老糖尿病模型組、二甲雙胍治療組、黃芪多糖+二甲雙胍治療組，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)60 d。測(cè)定小鼠體質(zhì)量、攝食、飲水、空腹血糖變化，HE染色觀察小鼠肝組織形態(tài)學(xué)，糖原染色和油紅O染色觀察肝組織糖脂代謝，透射電子顯微鏡觀察小鼠肝組織細(xì)胞超微形態(tài)。結(jié)果 ?與衰老對(duì)照組比較，衰老糖尿病模型組空腹血糖明顯升高、體質(zhì)量減輕、攝食和飲水明顯增加（P<0.05）。與衰老糖尿病模型組比較，各給藥組空腹血糖明顯降低、體質(zhì)量增加、攝食和飲水明顯減少（P<0.05）。HE染色顯示，與衰老對(duì)照組比較，衰老糖尿病模型組肝組織病變、壞死嚴(yán)重，各給藥組較模型組明顯改善，其中黃芪多糖+二甲雙胍治療組肝組織結(jié)構(gòu)改善最明顯。糖原染色與油紅O染色顯示，衰老對(duì)照組糖原、脂滴含量較少，衰老糖尿病模型組糖原、脂滴含量明顯增多;與衰老糖尿病模型組比較，各給藥組小鼠肝組織糖原和脂滴含量均顯著減少（P<0.05），且黃芪多糖+二甲雙胍治療組效果更明顯。透射電鏡觀察顯示，衰老糖尿病模型組較衰老對(duì)照組肝組織細(xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷嚴(yán)重，各治療組較模型組明顯緩解，且黃芪多糖+二甲雙胍治療組效果更明顯。結(jié)論? 黃芪多糖+二甲雙胍可通過(guò)對(duì)肝組織細(xì)胞線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的保護(hù)作用，改善衰老2型糖尿病小鼠模型的肝臟糖脂代謝。

關(guān)鍵詞：衰老2型糖尿病;二甲雙胍;黃芪多糖;肝臟;糖脂代謝;小鼠

中圖分類號(hào)：R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）02-0047-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.011

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Objective To observe the effects of astragalus polysaccharides combined with metformin on liver glucose and lipid metabolism in aging type 2 diabetic mice; To discuss the mechanism of action. Methods The models of aging type 2 diabetic mice were induced by high sugar and high fat diet combined with streptozotocin in natural aging mice. The experimental mice were divided into aging control group， aging diabetic model group， metformin treatment group and astragalus polysaccharides combined with metformin treatment group. Each administration group was given the corresponding medicine for gavage for 60 days. The changes of body weight， feeding， drinking water and fasting blood glucose were measured in each group. The morphological changes of liver tissues were observed by HE staining. Glycogen staining and oil red O staining were performed to observe the glycolipid metabolism of liver tissue. Transmission electron microscopy was used to observe the ultrastructural changes of liver cells. Results Compared with the aging control group， the fasting blood glucose increased significantly， the body weight decreased and the feeding and drinking water increased significantly in the aging diabetic model group （P<0.05）. Compared with the aging diabetic model group， the fasting blood glucose decreased significantly， the body weight increased， and the feeding and drinking water decreased significantly in each administration group （P<0.05）. HE staining showed that compared with the aging control group， pathological changes and necrosis of the liver tissue in the aging diabetic model group were more serious， but the administration groups were significantly improved compared with the model group. The improvement of liver tissue structures in astragalus polysaccharides combined with metformin treatment group was the most obvious. Glycogen staining and oil red O staining showed that the contents of glycogen and lipid droplets in the aging control group were fewer， and the contents of glycogen and lipid droplets in the aging diabetic model group increased significantly （P<0.05）. Compared with the aging diabetic model group， the contents of glycogen and lipid droplets in the liver tissues of the administration groups were significantly reduced （P<0.05）， and in the astragalus polysaccharide combined with metformin treatment group， the reductions were more obvious. Transmission electron microscopy showed that the mitochondria and endoplasmic reticulum in the liver tissue of the aging diabetic model group had more damage rather than those in the aging control group， and the administration groups were significantly relieved compared with the aging model group， and the effects of astragalus polysaccharide combined with metformin were better. Conclusion Astragalus polysaccharide combined with metformin can improve glucose and lipid metabolism of liver in aging type 2 diabetic mice models by protecting liver mitochondria and endoplasmic reticulum.

Keywords： aging type 2 diabetes; metformin; astragalus polysaccharides; liver; glucose and lipid metabolism; mice

隨著年齡增長(zhǎng)，機(jī)體常伴隨一系列生理和病理改變。其中2型糖尿病已成為老年人死亡的主要病因。目前治療糖尿病的常用藥物為二甲雙胍，但臨床發(fā)現(xiàn)，該藥在治療中存在單純用藥療效不佳，可能引起消化不良和低血糖等不良反應(yīng)^[1]。中醫(yī)認(rèn)為2型糖尿病因“脾虛肝郁、氣血兩虛”所致，其中“脾虛肝郁”影響更大^[2]。黃芪具有補(bǔ)氣健脾、抗衰老的功效，研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖具有調(diào)節(jié)免疫、提高胰島素分泌、減緩胰島素抵抗的作用^[3-5]。本研究采用黃芪多糖聯(lián)合二甲雙胍作用于衰老2型糖尿病小鼠模型，從肝臟糖脂代謝入手，探討黃芪多糖對(duì)衰老糖尿病的治療機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1? 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 動(dòng)物

雄性5月齡SPF級(jí)昆明種小鼠50只，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（甘）2015-0002。飼養(yǎng)于溫度20～25 ℃、相對(duì)濕度40%～70%環(huán)境，每日光照12 h，自由攝食飲水。

1.2? 藥物

黃芪多糖，上海索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)608B031;鹽酸二甲雙胍片，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)S24O8G46081。

1.3 ?主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（STZ），美國(guó)Sigma公司;多聚甲醛，中國(guó)Biosharp公司;25%戊二醛溶液，美國(guó)Sigma公司;HE染色試劑盒、PAS染色試劑盒、油紅O染液，中國(guó)索萊寶公司。美國(guó)羅氏活力型血糖儀、羅氏血糖試紙，德國(guó)Roche公司;光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司;透射電子顯微鏡，日本JEOL公司。

1.4? 造模及分組

將50只小鼠隨機(jī)分為衰老對(duì)照組12只，衰老糖尿病造模組38只。衰老對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)。衰老糖尿病造模參照文獻(xiàn)[6]，采用腹腔注射STZ制作糖尿病模型，先用高糖高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)小鼠4周，然后每只小鼠連續(xù)3 d腹腔注射70 mg/kg STZ，以連續(xù)2次空腹血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。造模4周后，衰老對(duì)照組小鼠死亡1只;衰老糖尿病模型造模成功33只，將其隨機(jī)分為衰老糖尿病模型組、二甲雙胍治療組和黃芪多糖+二甲雙胍治療組，每組11只。

1.5? 給藥

二甲雙胍用去離子水配制成100 g/L水溶液，按10 mL/（kg·d）灌胃二甲雙胍治療組小鼠;黃芪多糖配制成300 g/L水溶液，與100 g/L二甲雙胍等體積混合，按10 mL/（kg·d）灌胃黃芪多糖+二甲雙胍治療組小鼠;衰老對(duì)照組和衰老糖尿病模型組小鼠給予等量生理鹽水灌胃。每日1次，連續(xù)60 d。其中衰老糖尿病模型組有小鼠死亡，為便于統(tǒng)計(jì)分析，治療后以每組8只小鼠進(jìn)行分析。

1.6? 一般狀況測(cè)定

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，每周測(cè)定小鼠體質(zhì)量、攝食、飲水、空腹血糖（每次測(cè)量前禁食12 h）。

1.7? 肝組織形態(tài)觀察

小鼠斷頸處死后，摘取小鼠肝臟，生理鹽水漂洗干凈、濾紙吸干，選取一小葉，4%多聚甲醛浸泡，室溫固定，石蠟包埋，切片（厚約3 μm），脫蠟、水洗后HE染色，封片后顯微鏡觀察。

1.8? 肝糖原染色檢測(cè)

取包埋好的組織蠟塊，切片（厚約3 μm），進(jìn)行肝糖原PAS染色，顯微鏡觀察肝糖原含量。

1.9? 肝脂滴含量檢測(cè)

小鼠斷頸處死，摘取肝臟，移至1.5 mL凍存管中，置于液氮中冰凍，-80 ℃冰箱保存。取凍存的肝臟，制成6 μm厚的冰凍切片，并于室溫下進(jìn)行油紅O染色、異丙醇漂洗、蘇木素復(fù)染、中性甘油封片后鏡下觀察，并統(tǒng)計(jì)肝脂滴的面積，分析脂滴沉積量。

1.10? 肝臟透射電鏡觀察

將漂洗、吸干后肝臟修成大約1 mm³的小塊，放入4 ℃預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液中過(guò)夜固定，PBS漂洗3次，1%鋨酸染色、脫水、浸透、包埋、聚合后修塊，切成70 nm的薄片，復(fù)染后透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1.11? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，Image J軟件進(jìn)行光密度分析。計(jì)量資料以±s表示，各組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 一般狀況結(jié)果

衰老糖尿病造模組較衰老對(duì)照組有明顯的“三多一少”癥狀，即攝食、飲水、空腹血糖明顯增加，而體質(zhì)量顯著降低;治療后小鼠體質(zhì)量升高，攝食、飲水、空腹血糖較模型組明顯下降（P<0.05）;且黃芪多糖+二甲雙胍治療組體質(zhì)量、攝食、飲水、空腹血糖變化較二甲雙胍治療組更明顯。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2? 肝組織HE染色結(jié)果

衰老對(duì)照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，只在中央靜脈區(qū)有輕度的排列疏松并伴有輕度的氣球樣變;衰老糖尿病模型組小鼠肝組織細(xì)胞排列紊亂，有彌漫性肝細(xì)胞水腫，變性、壞死、氣球樣變，并伴有肝竇、肝靜脈淤血;二甲雙胍治療組小鼠肝組織細(xì)胞排列疏松，較模型組細(xì)胞水腫、變性減輕;黃芪多糖+二甲雙胍治療組小鼠肝組織細(xì)胞排列較衰老糖尿病模型組整齊，細(xì)胞水腫、變性明顯減輕。

2.3? 肝糖原PAS染色結(jié)果

衰老對(duì)照組小鼠肝糖原顆粒染色較淺且數(shù)量較少;衰老糖尿病模型組小鼠肝糖原明顯增多，呈彌漫性分布。二甲雙胍治療組和黃芪多糖+二甲雙胍治療組小鼠較衰老糖尿病模型組肝糖原均減少，其中黃芪多糖+二甲雙胍治療組肝糖原減少更顯著。

2.4? 肝組織脂滴代謝變化

各組小鼠肝臟冰凍切片油紅O染色結(jié)果顯示，衰老對(duì)照組肝組織中脂滴較少，衰老糖尿病模型組肝組織中脂滴含量明顯增多，且體積較大、染色較深。各治療組肝組織中脂滴含量較衰老糖尿病模型組均顯著減少（P<0.05）。

2.5? 肝組織透射電鏡觀察結(jié)果

電鏡觀察顯示，衰老對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞有退化的趨向，胞質(zhì)中有脂褐素顆粒沉積，部分線粒體有輕度腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列規(guī)則，形態(tài)正常;衰老糖尿病模型組小鼠肝細(xì)胞核皺縮顯著，核膜明顯不規(guī)則，出現(xiàn)線粒體融合，較多線粒體呈“管狀”和“空泡狀”，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、結(jié)構(gòu)紊亂;二甲雙胍治療組肝細(xì)胞核膜較完整，輕度皺縮，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹程度較衰老糖尿病模型組減輕;黃芪多糖+二甲雙胍治療組肝細(xì)胞核較衰老糖尿病模型組完整，皺縮不明顯，線粒體腫脹程度較衰老糖尿病模型組和二甲雙胍治療組減輕，未見(jiàn)空泡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列也規(guī)則，擴(kuò)張程度減輕。此外，電鏡觀察還發(fā)現(xiàn)衰老糖尿病模型組肝血竇間隙明顯擴(kuò)張，治療后肝血竇擴(kuò)張程度減輕。

3? 討論

衰老是糖尿病發(fā)病的重要誘因，年齡超過(guò)60歲的人群中，基礎(chǔ)血糖會(huì)升高10%以上，隨著年齡增加，脂肪也重新分布，胰島素抵抗更為明顯。而且老年性糖尿病患者常有病情復(fù)雜、合并癥多、糖尿病癥狀不典型等特點(diǎn)。

有研究利用D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老進(jìn)行造模^[7-8]，但劉克明等^[9]報(bào)道自然衰老小鼠存在明顯的免疫功能降低、學(xué)習(xí)行為能力降低等特點(diǎn)，而D-半乳糖致衰老對(duì)小鼠體內(nèi)的代謝環(huán)境進(jìn)行了人為干預(yù)，尚不能完全反映衰老的生理生化改變。因此，本實(shí)驗(yàn)利用自然衰老小鼠進(jìn)行造模，可更真實(shí)反映機(jī)體生理代謝變化。有報(bào)道，通過(guò)高糖高脂飼料與小劑量STZ進(jìn)行糖尿病模型的復(fù)制成功率可達(dá)80%^[10]。經(jīng)本研究復(fù)制，模型小鼠出現(xiàn)明顯的“三高一低”糖尿病特征，造模成功率較高。但由于本研究采用的小鼠為衰老小鼠，其基礎(chǔ)體征較差，較之前的報(bào)道后期死亡率較高，這也正反映了糖尿病合并衰老疾病模型的特異性。

以高血糖為特征的糖脂代謝紊亂為糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)。肝臟是糖脂代謝的重要場(chǎng)所，肝細(xì)胞含有大量線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可使肝細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取、利用增加，代謝加快，并轉(zhuǎn)化為肝糖原貯存在肝組織。通過(guò)二甲雙胍單獨(dú)治療及與黃芪多糖聯(lián)合治療后，小鼠肝組織病理結(jié)構(gòu)、糖原染色和脂滴含量均較衰老糖尿病模型組有明顯改善。而且聯(lián)合用藥組改善情況較優(yōu)于單獨(dú)用藥組，表明黃芪多糖聯(lián)合二甲雙胍對(duì)肝組織結(jié)構(gòu)有一定的保護(hù)作用，并可調(diào)節(jié)肝組織糖脂代謝紊亂。本研究通過(guò)進(jìn)一步電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，該調(diào)節(jié)作用可能與藥物作用保護(hù)肝組織細(xì)胞中線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)有關(guān)。各治療組較衰老糖尿病模型組線粒體腫脹和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯減輕。本研究結(jié)果顯示，隨著2型糖尿病合并衰老的發(fā)生，線粒體形態(tài)改變和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不斷加重，糖原及脂滴的沉積增加，肝組織病變也進(jìn)一步惡化。黃芪多糖聯(lián)合二甲雙胍可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激起到改善肝臟糖脂代謝的作用。

Novelle等^[11]發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍通過(guò)抑制線粒體復(fù)合酶Ⅰ的活性來(lái)降低ATP水平，其通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖酵解酶的表達(dá)來(lái)影響線粒體呼吸鏈，從而改善肝臟脂肪變性及炎性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可抑制由肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力引起的活化轉(zhuǎn)錄因子6的活性，增加2型糖尿病大鼠肝組織AMPK磷酸化水平，從而提高大鼠胰島素敏感性，增加大鼠對(duì)高血糖癥和口服葡萄糖的耐受性^[12]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析肝臟病理形態(tài)、糖脂代謝變化及電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖聯(lián)合二甲雙胍可通過(guò)改善肝臟糖脂代謝對(duì)衰老2型糖尿病小鼠有一定的治療作用，為探討衰老2型糖尿病治療的方法及思路提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] YEHUDA A B， ZINGER A. The older patient with diabetes： a practical approach[J]. Diabetes/metabolism Research & Reviews， 2014，30（2）：88-95.

[2] 李永民，李建東，楊潔，等.中藥糖平煎對(duì)實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病治療機(jī)理的研究[C]//中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)內(nèi)科分會(huì)消渴病學(xué)術(shù)研討會(huì)，2003.

[3] 毛竹君，壽旦，柴可夫.黃芪多糖小檗堿下調(diào)IR-INS-1細(xì)胞miR-126-3p改善胰島素抵抗[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（7）：2961-2965.

[4] 唐思?jí)簦瑮顫擅?，陳偉?qiáng)，等.黃芪多糖保護(hù)胰島β細(xì)胞改善大鼠2型糖尿病[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，38（4）：482-487.

[5] 胡彩虹，徐坤，孫靜，等.黃芪多糖對(duì)老年糖尿病大鼠糖脂代謝的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2018，38（6）：1453-1455.

[6] 許芳芳，王楠，李剛強(qiáng)，等.2型糖尿病小鼠模型的建立與評(píng)價(jià)[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2017，39（3）：324-329.

[7] 王晶，黃勇，李海龍，等.黨參水提物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腎組織microRNA表達(dá)譜的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2016，23（5）：69-72.

[8] 章常華，劉彤彤，鄧可眾，等.黃芩-黃連藥對(duì)防治D-半乳糖癡呆小鼠的作用機(jī)制[J].中成藥，2018，40（3）：524-529.

[9] 劉克明，王春花，李國(guó)星，等.D-半乳糖模型鼠與自然衰老鼠的比較研究[J].衛(wèi)生研究，2007（6）：685-688.

[10] 黃桂紅，陳薇，羅昱瀾.鏈脲佐菌素穩(wěn)定性對(duì)誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型的影響[J].華夏醫(yī)學(xué)，2009，22（2）：201-203.

[11] NOVELLE M G， ALI A， DIEGUEZ C， et al. Metformin：A hopeful promise in aging research[J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine，2016，6（3）：a025932.

[12] 常越，徐姣，閆嵩，等.黃芪六一湯對(duì)2型糖尿病治療效果的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[J].中國(guó)中藥雜志，2017，42（14）：2760-2766.