惠州市圍生期婦女B族鏈球菌耐藥性及其耐藥基因分析

林保安

[摘要]目的 分析圍生期婦女B族鏈球菌的耐藥性及其耐藥基因。方法 選取2016年1月～2017年9月惠州市第一婦幼保健院產(chǎn)科收治的657例圍生期婦女，取其生殖道分泌物，對B族鏈球菌進(jìn)行培養(yǎng)檢測，同時對培養(yǎng)出的B族鏈球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，觀察其耐藥性和分析耐藥基因。結(jié)果 在657例圍生期婦女中檢出B族鏈球菌攜帶者有213例，帶菌率為32.4%，其中≥30歲組的圍生期婦女帶菌率為42.3%，<30歲組的帶菌率為29.8%，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。B族鏈球菌對青霉素的耐藥率為0.8%，紅霉素為31.2%，頭孢曲松為6.3%，左氧氟沙星為22.5%，克林霉素為25.9%，四環(huán)素為63.2%，萬古霉素為0.0%，利奈唑胺為0.3%，呋喃妥因?yàn)?1.3%，氨芐西林為2.6%，D-抑菌圈試 頭孢曲松的敏感性高，可根據(jù)患者的具體病情選擇合適的藥物進(jìn)行治療。

[關(guān)鍵詞]圍生期婦女;B族鏈球菌;耐藥性;耐藥基因

[中圖分類號] R378.1+2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）1（c）-0142-04

圍生期是指孕婦懷孕28周到產(chǎn)后1周，是孕婦人生中的重要時刻，在這段時間中，孕婦會進(jìn)行各種檢查來確保自身和孩子的安全。B族鏈球菌又稱無乳鏈球菌，是一類β溶血的需氧革蘭陽性鏈球菌，一般存在于人體的下消化道，也可寄居于女性下生殖道，正常人在一般情況下感染可不致病，但該菌是導(dǎo)致母胎感染的重要菌素[1]，其與新生兒感染、晚期流產(chǎn)、圍生期感染等疾病密切相關(guān)。B族鏈球菌早期可引起牛乳房炎，因此被畜醫(yī)界所重視，但是隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)該致病菌的感染不只限于牛乳房炎，對人體也有很大的危害性。1938年Fry首次報道3例患者因感染B族鏈球菌引發(fā)心內(nèi)膜炎而導(dǎo)致死亡，證明B族鏈球菌為人類的致病菌。經(jīng)過不斷研究，發(fā)現(xiàn)B族鏈球菌可引起孕婦早產(chǎn)、胎膜感染、胎膜早破及引起子宮內(nèi)膜感染等，新生兒感染B族鏈球菌可導(dǎo)致肺炎、腦膜炎、敗血癥甚至死亡，而在感染后存活下來的新生兒中，還可能存在智力障礙、腦積水、耳聾、畸形等并發(fā)癥。有關(guān)研究表明，我國妊娠婦女的B族鏈球菌帶菌率為3.5%～32.4%，國外妊娠婦女的帶菌率為10%～30%，正常人的帶菌率為15%～35%[2]，B族鏈球菌為圍生期婦女感染的主要致病菌。目前國內(nèi)外對于B族鏈球菌的防治都采用β內(nèi)酰胺抗生素，而對于過敏性人群和輕微感染者常采用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[3]，但近年來由于抗生素的廣泛使用，B族鏈球菌的耐藥性逐年上升。本研究選取426例圍生期婦女，對B族鏈球菌的耐藥性和耐藥基因進(jìn)行分析，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年1月～2017年9月惠州市第一婦幼保健院產(chǎn)科收治的657例圍生期婦女，孕齡35～37周，年齡20～36歲，平均（26.4±3.5）歲。657例孕婦按年齡分分為兩組，≥30歲組235例，<30歲組422例。納入標(biāo)準(zhǔn)：在我院進(jìn)行產(chǎn)前檢查的孕婦，正常妊娠，年齡為20～40歲的孕婦。排除標(biāo)準(zhǔn)：近2周內(nèi)使用過抗生素;近2周內(nèi)有過性生活;有嚴(yán)重慢性疾病合并心腦腎等重要臟器功能受損者;意識不清楚;有精神疾病。所有患者均同意參加本研究，且都已簽署知情同意書。本研究已經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑

培養(yǎng)B族鏈球菌的培養(yǎng)基為哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、ToddHewrtt培養(yǎng)肉湯和綿陽血清培養(yǎng)基，均為上海瑪嘉微生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品[4]。B族鏈球菌的鑒定采用法國生物梅里埃公司VITEK2全自動細(xì)菌鑒定分析儀，藥敏定量試驗(yàn)采用法國生物梅里埃的VITEK2全自動鑒定藥敏儀[5]。質(zhì)控菌株為肺炎鏈球菌ACTT49615，該產(chǎn)品于中國衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心采購。DNA提取試劑盒（批號54926）為中國北京生物工程有限公司提供，D-抑菌圈試驗(yàn)使用美國OXOID公司的紙片。

1.3標(biāo)本采集

由我院婦產(chǎn)科醫(yī)生對孕婦采集生殖道分泌物標(biāo)本。孕婦于2周前未使用過任何抗菌藥物，未進(jìn)行過性生活，采集部位沒有使用過栓劑和清洗液，未進(jìn)行任何清洗[6]，將陰道采用消毒過后的擴(kuò)陰器打開，用無菌棉簽拭子涂擦陰道下1/3處，將采集好的標(biāo)本放置于容器內(nèi)并于30 min內(nèi)送檢。

1.4菌株鑒定

將采集好的無菌棉簽拭子放置到B族鏈球菌選擇性增菌肉湯中，環(huán)境溫度保持在35 ℃以下[7]，經(jīng)過一夜的培養(yǎng)后，進(jìn)而接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，溫度繼續(xù)保持在35 ℃以下，空氣為5%CO2，培養(yǎng)24～48 h，選擇中等大小、灰白色的菌群于血瓊脂培養(yǎng)基上給予純培養(yǎng)，并進(jìn)行革蘭染色，最后于顯微鏡下進(jìn)行觸酶試驗(yàn)、CAMP試驗(yàn)以及ATB32streP板條鑒定菌落的種類[8]。

1.5藥敏試驗(yàn)

選取青霉素、萬古霉素、利奈唑胺、胺芐西林、頭孢曲松、呋喃妥因、左氧氟沙星、克林霉素、紅霉素、四環(huán)素抗菌藥物紙片進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，將準(zhǔn)備測試的菌落稀釋為0.5麥?zhǔn)蠁挝缓蠼臃N到綿陽血清培養(yǎng)基上，待菌液風(fēng)干后將抗菌藥物紙片貼在上面，間距為12 mm，在35℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)24～48 h[9]，參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會制定的MI00-S22文種對藥敏結(jié)果進(jìn)行判斷，對于克林霉素、紅霉素敏感的或中介的菌株，運(yùn)用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行D-抑菌圈實(shí)驗(yàn)。

1.6耐藥基因檢測

采用PCR方法檢測D-抑菌圈試驗(yàn)陽性B族鏈球菌菌株的耐藥基因，反應(yīng)體系總體積25 μl，其中包括ddH2O 17 μl 10×PCR buffer 2.5 μl，dNTP 0.5 μl，Taq DNA Polymerase 0.25 μl，鎂離子1.5 μl，上下游引物各1 μl，模板DNA 1.25 μl，反應(yīng)條件為：5 min 95℃預(yù)變性[10]，95℃變性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s，總共進(jìn)行35個循環(huán)，最后一個循環(huán)結(jié)束后72℃ 10 min，最后在4℃的條件下保存PCR產(chǎn)物[11]。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 圍生期婦女B族鏈球菌帶菌率

在657例圍生期婦女中檢出B族鏈球菌攜帶者213例，帶菌率為32.4%，其中≥30歲組的圍生期婦女帶菌率為42.3%，<30歲組的帶菌率為29.8%，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.045，P<0.05）。

2.2 圍生期婦女B族鏈球菌耐藥性分析

對213例B族鏈球菌進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，結(jié)果顯示，B族鏈球菌對克林霉素、紅霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星耐藥性較高，分別為25.9%、31.2%、63.2%、22.5%;對青霉素、萬古霉素、利奈唑胺、胺芐西林、呋喃妥因和頭孢曲松的敏感性高，分別為99.2%、100.0%、99.7%、97.4%、88.4%、93.7%（表1）。

2.3 D-抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果

213例B族鏈球菌中，對克林霉素敏感、紅霉素耐藥或者中介者56例，在56例中D-抑菌圈試驗(yàn)陽性者有14例，陽性率為25.0%。

2.4圍生期婦女B族鏈球菌耐藥基因分析

在213例感染的B族鏈球菌中，四環(huán)素的耐藥基因以tetM、tetO、tetK、tetL為主，其陽性率分別為71.2%、54.3%、16.7%、46.5%，其中包含兩種或兩種以上的tet基因占71.8%;紅霉素的耐藥基因主要以ermB為主，其陽性率為31.6%，mefA基因陽性為21.3%，mefE基因陽性為29.8%，ermC基因陽性和ermTR基因陽性分別有12例，同時含有erm基因和erfA和mefE基因的為36.8%。

3討論

B族鏈球菌是一種條件致病菌，主要存在于人體的陰道和直腸，在人體免疫力低下時，內(nèi)環(huán)境可出現(xiàn)異常，導(dǎo)致機(jī)體失去平衡而發(fā)生感染，如果不進(jìn)行及時有效的干預(yù)，易引發(fā)多種類型的感染。B族鏈球菌是導(dǎo)致圍生期婦女感染的主要致病菌之一，孕婦感染B族鏈球菌的早期表現(xiàn)為外陰瘙癢、陰道分泌物增多，尿頻等，隨著時間的延長，孕婦到了圍生期可導(dǎo)致胎膜早破、子宮內(nèi)膜感染和晚期流產(chǎn)等并發(fā)癥。新生兒感染B族鏈球菌可導(dǎo)致腦膜炎、肺炎、敗血癥等感染性疾病，發(fā)病率和死亡率較高，有關(guān)研究表明，在圍生期孕婦感染B族鏈球菌新生兒敗血癥的發(fā)生率比未感染B族鏈球菌的圍生期婦女高25倍[12]，且其帶菌率隨著地區(qū)、種族、年齡的不同而有差別，有研究表明，妊娠期婦女的帶菌率為10%～30%，健康人群的帶菌率為15%～35%，我國南京地區(qū)的孕婦帶菌率為4.2%，江西地區(qū)的帶菌率為8.76%，上海地區(qū)的帶菌率為3.70%，北京地區(qū)的帶菌率為7.10%[13]。對圍生期婦女采集陰道分泌物進(jìn)行B族鏈球菌的篩查，同時對檢測出的B族鏈球菌感染的患者進(jìn)行抗生素的預(yù)防用藥，可極大地降低孕婦和新生兒感染的危險。

B族鏈球菌的檢查方法主要有血清學(xué)檢測和細(xì)菌培養(yǎng)法，細(xì)菌培養(yǎng)法是確診B族鏈球菌的有效方法。本研究所采用的是細(xì)菌培養(yǎng)法，檢測出有213例圍生期婦女感染B族鏈球菌，帶菌率為32.4%，提示在圍生期婦女中B族鏈球菌感染率較高，臨床上應(yīng)予以重視。細(xì)菌培養(yǎng)法的不足之處在于對B族鏈球菌的分離培養(yǎng)和診斷過程耗費(fèi)時間長且相對復(fù)雜，血清學(xué)檢測可大大縮短時間，但是容易出現(xiàn)假陰性和假陽性，在臨床上都不能廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)在分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床上，熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)成為臨床診斷中的一種重要技術(shù)，其特點(diǎn)為準(zhǔn)確性高，速度快，敏感性高，取得的標(biāo)本送到實(shí)驗(yàn)室之后40～100 min內(nèi)就可得到準(zhǔn)確的檢查結(jié)果，但其對檢測人員和設(shè)備的要求較高，且費(fèi)用相對比較昂貴，并且不能獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果[14]。

對感染B族鏈球菌的圍生期婦女應(yīng)給予積極有效的治療，及時采取抗生素治療可以有效減少圍生期婦女和新生兒感染的發(fā)生，美國疾病預(yù)防控制中心推薦選取青霉素G、胺芐西林來預(yù)防圍生期婦女B族鏈球菌的感染，對此類藥物過敏的患者，可使用克林霉素和紅霉素[15]?？咕幬锏膹V泛使用使B族鏈球菌的耐藥性越來越高，本研究結(jié)果顯示，B族鏈球菌對青霉素、萬古霉素、利奈唑胺、胺芐西林、呋喃妥因和頭孢曲松敏感性分別為99.2%、100%、99.7%、97.4%、88.4%、93.7%，提示青霉素和萬古霉素是治療B族鏈球菌感染患者的首選藥物，對克林霉素、紅霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星耐藥性較高，分別為25.9%、31.2%、63.2%、22.5%，這可能與目前臨床上廣泛應(yīng)用青霉素有關(guān)，濫用抗生素對多數(shù)的敏感菌株產(chǎn)生影響，且不能被消滅的耐藥菌率就大量繁殖，在很大程度上代替了敏感菌株，使B族鏈球菌對該種藥物的耐藥率不斷上升。同時本研究結(jié)果顯示，紅霉素的耐藥基因主要以ermB為主，其陽性率為31.6%，mefA基因陽性為21.3%，mefE基因陽性為29.8%，ermC基因陽性和ermTR基因陽性分別有12例，同時含有erm基因和erfA和mefE基因的為36.8%，四環(huán)素的耐藥基因以tetM、tetO、tetK、tetL為主，在很大程度上增加了患者的耐藥性，使得這些基因能在菌群之間大量傳播。

綜上所述，圍生期婦女B族鏈球菌感染發(fā)生的風(fēng)險較大，為了進(jìn)一步控制和防止其耐藥性的發(fā)展，應(yīng)對其耐藥基因進(jìn)行全面檢測，根據(jù)患者的具體病情選擇合適的藥物進(jìn)行治療。

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（收稿日期：2018-07-26? 本文編輯：張晨暉）