酸棗仁合劑質(zhì)量綜合評價*

王瑞芳，牟勝群，張秋紅

（1. 山東第一醫(yī)科大學附屬濟南婦幼保健院，山東 濟南 250000； 2. 山東省濟南市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濟南 271100）

酸棗仁合劑由酸棗仁、知母、茯苓、川芎和甘草組方，可清熱瀉火、養(yǎng)血安神，治療虛煩不眠、心悸不寧、頭目眩暈等病癥療效顯著［1］。現(xiàn)有藥品標準中未對方中成分進行定量控制，中國知網(wǎng)、萬方和維普等數(shù)據(jù)庫亦未收錄相關文獻。中藥及中成藥所含成分復雜多樣，中藥材種屬、產(chǎn)地、初加工方式的不同會導致產(chǎn)品質(zhì)量存在明顯差異，定性或單一成分定量質(zhì)量評價模式存在一定的局限性，難以進行全面質(zhì)量控制。鑒于此，本研究中建立了測定不同廠家12 批酸棗仁合劑中13 種指標性成分含量的一測多評（QAMS）法，同時建立了灰色關聯(lián)度和熵權優(yōu)劣解距離（TOPSIS）模型對制劑質(zhì)量進行分析評價，旨在為該制劑多指標成分的綜合質(zhì)量評價提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10AT型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；EL2401型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

酸棗仁合劑（生產(chǎn)企業(yè)A，批號分別為20210901，20211005，20211207，20220305，編號S1-S4；生產(chǎn)企業(yè)B，批號分別為210704，210901，211212，211213，編號S5-S8；生產(chǎn)企業(yè)C，批號分別為210711，211216，220402，220503，編號S9-S12；規(guī)格均為每支10 mL）；洋川芎內(nèi)酯I 對照品（批號為112071 - 202101，含量99.2%），芒果苷對照品（批號為111607-201704，含量98.1%），酸棗仁皂苷A 對照品（批號為110734 - 201914，含量96.0%），酸棗仁皂苷B 對照品（批號為110814 -201809，含量96.2%），斯皮諾素對照品（批號為111869-202005，含量94.8%），均購于中國食品藥品檢定研究院；去氫茯苓酸對照品（批號為PS010107，含量91.2%），茯苓酸對照品（批號為PS010073，含量99.7%），均購于成都普思生物科技股份有限公司；新芒果苷對照品（批號為PRF7080245，含量99.0%），藁本內(nèi)酯對照品（批號為PRF8070601，含量99.2%），異芒果苷對照品（批號為PRF9092642，含量99.8%），6'''-阿魏酰斯皮諾素對照品（批號為PRF8010622，含量99.3%），洋川芎內(nèi)酯H對照品（批號為PRF15121422，含量98.7%），洋川芎內(nèi)酯A對照品（批號為PRF10030141，含量99.6%），均購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；乙腈、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：InertSustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：0.05%磷酸水溶液（A）- 乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min 時13%B，10～21 min 時13%B →17%B，21～36 min 時17%B →35%B，36～47 min 時35%B →72%B，47～62 min 時72%B →90%B，62～70 min 時90%B →13%B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：258 nm（新芒果苷、芒果苷、異芒果苷，0～21 min）［2-9］，210 nm（斯皮諾素、6'''-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、去氫茯苓酸、茯苓酸，21～47 min）［10-16］，280 nm（洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯，47～70 min）［17-20］；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備

取13 個對照品各適量，精密稱定，加70%乙醇，制成每1 mL含新芒果苷0.910 mg、芒果苷0.492 mg、異芒果苷0.076 mg、斯皮諾素0.358 mg、6''' - 阿魏酰斯皮諾素0.296 mg、酸棗仁皂苷A 0.270 mg、酸棗仁皂苷B 0.148 mg、去氫茯苓酸0.092 mg、茯苓酸0.198 mg、洋川芎內(nèi)酯H 0.124 mg、洋川芎內(nèi)酯I 0.218 mg、洋川芎內(nèi)酯A 0.430 mg和藁本內(nèi)酯0.572 mg的混合對照品貯備液；用70%乙醇稀釋20 倍，制得13 種對照品質(zhì)量濃度分別為45.50，24.60，3.80，17.90，14.80，13.50，7.40，4.60，9.90，6.20，10.90，21.50，28.60 μg/ mL 的混合對照品溶液。精密量取樣品1 mL，置25 mL 容量瓶中，用70%乙醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按酸棗仁合劑處方及工藝分別制備缺知母、酸棗仁、茯苓和川芎的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備相應的陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性與專屬性試驗：精密吸取2.1.2項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果陰性對照品溶液色譜中，在與混合對照品溶液色譜相同保留時間處無干擾峰，專屬性良好；理論板數(shù)按13種待測成分峰計均不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Neomangiferin 2.Mangiferin 3.Isomangiferin 4.Spinosin 5.6''' - Feruloylspinosin 6.Jujuboside A 7.Jujuboside B 8.Dehydropachymic acid 9.Pachymic acid 10.Senkyunolide H 11.Senkyunolide I 12.Senkyunolide A 13.LigustilideA.Mixed reference solution B.Test solution C - F.Negative reference solution（lacking Anemarrhenae Rhizoma，Ziziphi Spinosae Semen，Poria and Chuanxiong Rhizoma respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密吸取2.1.2項下混合對照品貯備液適量，共6份，用70%乙醇逐級稀釋，制成不同質(zhì)量濃度的系列混合對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以待測成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表1。

凍結法是利用人工制冷技術，使地層中的水結冰，把天然的巖土變成凍土，增加其強度和穩(wěn)定性，隔絕地下水與地下工程的聯(lián)系，以便在凍結壁的保護下進行施工。其工作原理是采用二氧化碳膨潤土和液態(tài)氮等方式，或采用液壓系統(tǒng)與機械制冷設備相互連接，讓冷卻液在土壤中進行流動，促使軟濕土逐漸進行凍結，在提升土體的強度的同時，極大地降低了土壤的壓縮性。凍結法可以應用于各類土壤得施工之中，在挖掘深度＞7～8m或者地下水位偏低的時候，這種方法極大地提高了施工效率。

表1 線性關系考察結果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test（n = 6）

精密度試驗：取供試品溶液（編號S1）適量，按2.1.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄13 個待測成分的峰面積。結果的RSD均小于2.0%（n= 6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液（編號S1）適量，室溫分別放置0，2，4，6，10，16，24 h 時按擬訂色譜條件進樣測定，記錄13 個成分的峰面積。結果的RSD均小于2.0%（n=7），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：取樣品（編號S1）適量，共6 份，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄13 個待測成分的峰面積，計算平均含量。結果的RSD均小于2.0%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取樣品（編號S1）9 份，每份0.5 mL，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（%，n=9）Tab.2 Results of the recovery test（%，n = 9）

2.1.4 相對校正因子（f）的計算

精密吸取線性關系考察項下系列混合對照品溶液10μL，共6 份，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄13 個待測成分的峰面積，以斯皮諾素為內(nèi)參物（i），計算其他待測成分（s）的f，公式為f=（Ci×As）/（Cs×Ai）計算。式中，C，A，s 依次代表質(zhì)量濃度、峰面積、其他待測成分。結果見表3。

表3 各待測成分相對校正因子（n=6）Tab.3 RCFs of ingredients to be tested（n = 6）

2.1.5 耐用性考察

表4 相對校正因子耐用性考察結果Tab.4 Results of durability test of RCFs

表5 相對保留時間耐用性考察結果Tab.5 Results of durability test of relative retention time

2.1.6 樣品含量測定

取12 批樣品各適量，分別按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，取10 μL，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以外標法（ESM）計算各成分含量；再以斯皮諾素為內(nèi)參物，采用QAMS 法計算另外12 個待測成分的含量。結果2 種方法測得結果均無顯著差異（P>0.05），詳見表6。

表6 樣品含量測定結果（mg/mL，n=3）Tab.6 Results of content determination of 13 ingredients in samples（mg / mL，n = 3）

2.2 質(zhì)量評價

2.2.1 灰色關聯(lián)度分析

原始數(shù)據(jù)標準化處理：以表6中QAMS法測得13個成分（評價指標）的含量數(shù)據(jù)為變量，建立12 批樣品質(zhì)量灰色模式識別數(shù)據(jù)集（12 × 13），按公式Yik=Zik/Zbk（Zik為13 個評價指標QAMS 法含量數(shù)據(jù)，Zbk為第k個評價指標含量檢測結果的平均值）對12 批樣品和13 個評價指標數(shù)據(jù)進行標準化處理，結果見表7。

表7 12批樣品原始數(shù)據(jù)標準化處理結果Tab.7 Results of raw data normalization of 12 batches of samples

關聯(lián)系數(shù)及關聯(lián)度計算：選擇12 批樣品中每項指標的最大值為最優(yōu)參考序列Ybj，各評價指標的最小值為最差參考序列Ysj，由表7 得，Ybk為1.294 9，1.322 5，1.515 2，1.375 6，1.320 8，1.376 6，1.596 5，1.244 4，1.248 1，1.408 5，1.570 0，1.357 2，1.302 7，Ysk為0.754 4，0.668 7，0.524 5，0.614 9，0.770 2，0.705 3，0.457 9，0.784 8，0.626 6，0.714 3，0.584 7，0.741 6，0.761 4。分別按公式=(Δmin+ρΔmax)/(|Yik-Ybk|+ρΔmax)和（式中Δmin= min｜Yik-Ybk｜，Δmax= max｜Yik-Ybk｜，Δ'mix= min｜Yik-Ysk｜，Δ'max=max｜Yik-Ysk｜；ρ為分辨系數(shù)，取0.5）計算各評價單元相對于最優(yōu)、最差參考序列的關聯(lián)系數(shù)關聯(lián)度為每個被評價對象的所有評價指標關聯(lián)系數(shù)的平均值，分別按公式Ri(b)=計算被評價對象相對于最優(yōu)、最差參考序列的關聯(lián)度，結果見表8。再根據(jù)公式Ri=Ri(b)/(Ri(b)+Ri(s))計算被評價對象的相對關聯(lián)度Ri，Ri值越大，排名越靠前，質(zhì)量越優(yōu)。

表8 12批樣品相對于最優(yōu)及最差參考序列的關聯(lián)度Tab.8 Correlation degree of 12 batches of samples relative to the best and worst reference sequences

2.2.2 熵權TOPSIS 分析

歸一化決策矩陣：以12 批樣品中13 個待測成分QAMS 法所測含量數(shù)據(jù)為變量，按公式xik=[xik-min(xk)]/[max(xk)- min(xk)]進行歸一化處理后建立13個指標決策矩陣Xik（i=1，2，3，…，12；k=1，2，3，…，13），結果見表9。

表9 12批樣品原始數(shù)據(jù)歸一化處理結果Tab.9 Results of raw data normalization of 12 batchs of samples

熵權法各評價指標的權重計算及決策矩陣：熵權法利用熵值來判斷指標的離散程度，計算各指標相對權重，為多指標綜合評價提供依據(jù)，信息熵值越小，指標的離散程度就越大，該指標在綜合評價所占相對權重就越大。按公式lnZ（式中，Zikik=若Zik=0，則lnZik=0）計算13 個評價指標的信息熵，再按公式計算13 個評價指標的相對權重，結果見表10。再根據(jù)公式Yik=Xik×Wk得熵權決策矩陣，結果見表11。

表10 樣品中13個待測成分的信息熵及相對權重Tab.10 Information entropy and relative weight of 13 ingredients to be tested in samples

表11 12批樣品加權決策矩陣表Tab.11 Weighted decision matrix of 12 batches of samples

歐氏貼近度（Di）計算：樣品的13 個評價指標中對應樣品的最大、最小值分別為最優(yōu)、最劣方案，由表11可知，最優(yōu)方案=0.079 7，0.072 0，0.079 9，0.066 3，0.085 1，0.072 3，0.081 1，0.062 8，0.066 0，0.092 1，0.079 9，0.079 8，0.083 1，最劣方案均為0。按公式分別計算12批樣品與正理想解距離和負理想解距離，結果見表12。再按公式分別計算Di值。Di值越大，排名越靠前，被評價對象綜合質(zhì)量越優(yōu)。

表12 12批樣品的正理想解距離和負理想解距離Tab.12 Positive and negative ideal solution distance of 12 batches of samples

2.2.3 樣品質(zhì)量評價

按灰色關聯(lián)度分析中相對關聯(lián)度和熵權逼近理想解排序分析中歐氏貼近度大小對12批樣品質(zhì)量優(yōu)劣進行排序，結果見表13。

表13 12批樣品質(zhì)量評價結果Tab.13 Results of quality evaluation of 12 batches of samples

3 討論

3.1 評價模式選擇

近年來，采用多組分定量分析以控制中藥及其制劑整體質(zhì)量已成為共識，隨著研究的進一步深入，部分對照品質(zhì)量不穩(wěn)定，價格昂貴，檢驗成本過高等不利因素也隨之出現(xiàn)，直接阻礙了多組分定量控制模式的普及應用。QAMS技術通過挖掘中藥成分間的內(nèi)在函數(shù)關系，選取某一質(zhì)量穩(wěn)定、價格低廉且易得的典型組分為參照物，計算其他組分與其的f，實現(xiàn)了多組分的同步定量檢測，推動了多組分質(zhì)控模式的普及應用?；疑P聯(lián)度分析法和熵權TOPSIS法均屬目標決策分析中有效的分析方法，可有效解決中藥材質(zhì)量評價過程中多元化的成分信息。灰色關聯(lián)度分析通過度量變量發(fā)展趨勢的相同或相異程度衡量相關性，避免了以多個指標對其綜合評判值的人為判斷［21］，熵權TOPSIS 法對觀察指標進行客觀賦權，得到權重系數(shù)，能客觀地反映各評價指標與總得分的接近程度，使評價結果更有依據(jù)，且客觀真實［22］。故本研究中綜合選取上述方法評價樣品質(zhì)量。

3.2 指標成分選擇

依據(jù)中藥質(zhì)量標志物選擇原則，以處方中君藥所含成分為首選，同時兼顧臣藥、佐藥、使藥成分。本試驗中選取知母、酸棗仁、茯苓和川芎為分析對象，以知母所含芒果苷、新芒果苷和異芒果苷，酸棗仁所含斯皮諾素、6'''-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A 和酸棗仁皂苷B，茯苓所含去氫茯苓酸和茯苓酸，川芎所含洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯為評價指標，取質(zhì)量穩(wěn)定、價格低廉的斯皮諾素為內(nèi)參物，采用QAMS 法同時測定上述13 個待測成分的含量，且結果與ESM 法含量測定結果無明顯差異，表明所建立的方法可行。

3.3 流動相選擇

預試驗中選擇乙腈為有機相，對水相0.2%冰醋酸［4］、0.05%磷酸［7］、0.1%磷酸［22］水溶液和水［13］進行考察，結果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.05%磷酸水溶液為流動相時，13 個待測成分色譜峰穩(wěn)定，基線較平穩(wěn)，分離效果較好。為進一步完善檢測效果，又對有機相和水相比例進行了摸索，最終確定按2.1.1 項下方法測定樣品中13 個待測成分的含量。

3.4 結果分析與方法評價

本試驗中建立了酸棗仁合劑13個指標成分含量測定的QAMS 法，并采用灰色關聯(lián)度法聯(lián)合熵權TOPSIS法對3 個廠家12 批樣品的質(zhì)量進行了綜合評價，2 種方法的分析結果基本一致，均以編號S12，S10，S9，S11 排名前4，編號S2，S3，S4，S1 排名居中，編號S6，S8，S7，S5排名后4。結果表明，同一生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品質(zhì)量相對穩(wěn)定，而不同生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品質(zhì)量差異較大。本研究中建立的酸棗仁合劑定量控制方法和綜合評價模型相對全面、便捷，避免了人為因素導致的差異，提高了檢測結果的客觀性，有助于藥品生產(chǎn)企業(yè)通過數(shù)據(jù)比對，挖掘原藥材- 半成品- 成品之間各成分含量的變化趨勢，以及篩選優(yōu)質(zhì)原藥材，優(yōu)化生產(chǎn)過程參數(shù)，為酸棗仁合劑多指標質(zhì)量評價與控制提供了新思路。