P27基因參與子癇前期發(fā)生機制的研究進展

范卓然，顧艷，華紹芳

子癇前期（pre-eclampsia，PE）是妊娠期特發(fā)疾病，是導致母體、胎兒和新生兒患病率與死亡率增加的重要原因。盡管PE的確切發(fā)病機制尚不明確，但發(fā)生于孕34周前的早發(fā)型子癇前期（early onset preeclampsia，EOPE）與滋養(yǎng)細胞侵入障礙、胎盤缺氧關(guān)系密切，并增加胎兒生長受限（fetal growth restriction，F(xiàn)GR）風險[1]。胎盤是具有轉(zhuǎn)運、分泌、防御等多種功能的重要胎兒附屬物，其形成及功能發(fā)揮取決于滋養(yǎng)細胞正常的增殖、凋亡、分化與侵入過程[2]。P27基因作為周期蛋白/周期蛋白激酶抑制蛋白（CiP/kiP）家族重要成員參與細胞周期的正常進展[3]?，F(xiàn)就P27基因與PE發(fā)生機制的相關(guān)性研究進行綜述。

1 P27基因與細胞周期

真核細胞周期的正常進展需要細胞周期蛋白（Cyclin）、細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）配合cyclin促進細胞增殖，并依靠細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin dependent kinase inhibitors，CKIs）進行調(diào)節(jié)。CKIs常與 Cyclin、CDKs或Cyclin/CDK復合體結(jié)合阻止CDKs的活動，CKIs按其結(jié)構(gòu)與功能分為CDK4抑制劑（Ink4）家族與CiP/kiP家族，P27基因則屬于CiP/kiP家族[4]。P27基因定位于第12號染色體上，常與Cyclin/CDK結(jié)合阻止細胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)變，CDK2是P27蛋白的主要結(jié)合目標，P27基因的表達在G0和G1早期較豐富，其與CyclinE/CDK2結(jié)合并阻止其活性。在P27蛋白的氨基端有與Cyclin/CDK結(jié)合的激酶抑制結(jié)構(gòu)域，由Cyclin結(jié)合區(qū)和激酶結(jié)合區(qū)組成，P27蛋白通過激酶結(jié)合區(qū)與CDK2結(jié)合，通過Cyclin結(jié)合區(qū)與CyclinE相互作用[5]。作為一種抑癌基因，P27阻止細胞周期進展的作用已有報道，而近年又有研究顯示P27對細胞分化、凋亡與遷移也有重要影響，并在一定條件下可能發(fā)揮促進細胞增殖或抑制細胞增殖的作用[6]。

2 PE患者胎盤P27表達

細胞周期調(diào)節(jié)因子可能通過調(diào)控滋養(yǎng)細胞增殖與分化而在PE患者胎盤病理中發(fā)揮重要作用，PE患者胎盤滋養(yǎng)細胞存在異常增殖及凋亡增多[7]。細胞周期調(diào)節(jié)因子如何協(xié)調(diào)滋養(yǎng)細胞的增殖與分化，影響其增殖與分化的因素有哪些，以及PE患者改變滋養(yǎng)細胞生長的機制都尚不明確，因此了解細胞周期因子在病理性胎盤中的作用尤為重要。

Unek等[8]研究發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠對照組相比，PE患者胎盤組織存在更為顯著的鈣化、合體細胞結(jié)節(jié)、絨毛間與絨毛內(nèi)纖維素樣沉積等病理改變；在胎盤基板上，纖維素樣沉積、壞死部位更多見。P27基因在胎盤絨毛細胞滋養(yǎng)細胞、合體細胞-吞噬細胞、絨毛間質(zhì)細胞、絨毛外滋養(yǎng)細胞、羊膜上皮及絨毛膜間質(zhì)細胞中的表達、染色強度均明顯增加，在細胞外滋養(yǎng)細胞中增加更加明顯。其增加可能與絨毛外滋養(yǎng)細胞的侵入減少有關(guān)，這可能也是PE患者胎盤早剝發(fā)生率比正常孕婦高3倍的重要原因[9]。增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）及核抗原Ki-67等增殖標志物在PE患者胎盤中顯著減少，細胞周期抑制因子P27和P57基因的表達明顯增加。這一改變可能與侵襲性滋養(yǎng)層細胞凋亡增加有關(guān)[9]。

3 P27基因參與PE的發(fā)病機制

3.1 P27蛋白、CDK細胞質(zhì)易位調(diào)節(jié)細胞增殖P27可在細胞質(zhì)與細胞核內(nèi)自由穿梭從而發(fā)揮不同作用。正常情況下，G0期P27蛋白只定位于細胞核內(nèi)并阻止CDK2活性，G1期P27逐漸移至細胞質(zhì)，細胞進入S期，CyclinE蛋白水平上升，其與CDK2結(jié)合并活化，從而導致P27的T187殘基磷酸化，使P27變得不穩(wěn)定并通過泛素-蛋白酶體途徑降解，P27失去CKIs的作用，從而使CDK2和CyclinE/A復合體恢復活性并參與DNA復制的啟動，P27在G1期很快被水解，在S期時已很少能檢測到[10]。轉(zhuǎn)化生長因子 β（transforming growth factor β，TGF-β）對調(diào)節(jié)多種類型細胞的增殖與分化至關(guān)重要，通過TGF-β的Ⅰ型受體抑制劑抑制TGF-β的信號轉(zhuǎn)導，發(fā)現(xiàn)P27的不穩(wěn)定性增加，有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β可促進P27的細胞質(zhì)易位，在腫瘤細胞胞質(zhì)中的P27可能發(fā)揮致癌作用[11]。作為TGF-β超家族成員，Nodal信號通路與P27基因的表達關(guān)系密切。激活素受體樣激酶 7（activin receptor-like kinase，ALK7）是TGF-β的Ⅰ型受體。有研究顯示，Nodal過表達或ALK7上調(diào)增加P27 mRNA在滋養(yǎng)細胞中的水平[12]。另外，轉(zhuǎn)染重組Nodal（rNodal）或ALK7的滋養(yǎng)細胞P27蛋白水平較未轉(zhuǎn)染組也有增高，且蛋白質(zhì)的存在時間也較未轉(zhuǎn)染組明顯延長，說明Nodal影響P27蛋白的穩(wěn)定性[12]。在用編碼Nodal前體（N53）或成熟Nodal（N56）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的滋養(yǎng)細胞中，P27主要存在于細胞質(zhì)，而正常滋養(yǎng)細胞P27幾乎全部限制于細胞核內(nèi)。P27常與CDK2形成復合物以阻斷G1/S期進程來阻止細胞增殖[13]，而Nodal未轉(zhuǎn)染組CDK2檢測其位于細胞核，轉(zhuǎn)染組則可在細胞質(zhì)中檢測到，說明Nodal/ALK7誘導P27和CDK2的細胞質(zhì)易位，且細胞質(zhì)中的P27仍保留細胞周期抑制功能[12]。在rNodal轉(zhuǎn)染組，P27被運輸?shù)郊毎|(zhì)，但并沒有導致S期的進展或P27蛋白的降解。相反，rNodal誘導的細胞的細胞質(zhì)中有P27的積累，且將細胞阻滯于G1期，減少細胞增殖。Nodal有兩型受體，即ALK4和ALK7。TGF激活A(yù)LK5使激活素A（Activin-A）與ALK4結(jié)合，促使轉(zhuǎn)錄激活因子Smad2/3磷酸化[14]。將滋養(yǎng)細胞分別轉(zhuǎn)染Activin-A、rNodal及活性ALK7或 ALK5、ALK4 后發(fā)現(xiàn)，rNodal、TGF-β1、活性 ALK7或ALK5可使P27蛋白和CDK2細胞質(zhì)易位增加，而Activin-A、ALK4無此作用，這些結(jié)果表明，P27和CDK2的細胞質(zhì)易位可能是生長因子抑制滋養(yǎng)細胞增殖和細胞遷移的共同特征[12]。P27的功能主要是通過翻譯后修飾來調(diào)節(jié)，如磷酸化，其決定蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和亞細胞定位，及在細胞核與細胞質(zhì)中積累的復雜過程[13]。P27基因細胞核的表達被證明可調(diào)控細胞周期，在大多數(shù)腫瘤細胞中，P27在細胞質(zhì)中被磷酸化降解，細胞質(zhì)中的P27不能發(fā)揮其作為CKIs的功能，而Nodal可增加P27的細胞質(zhì)易位并保留其功能[15]。

研究顯示P27基因的T198、T157、S10磷酸化可能與引起P27細胞質(zhì)滯留有關(guān)。P27的核定位序列（nuclear location sequence，NLS）包含 Thr157、Thr178殘基，通過蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）對T157、T178殘基的磷酸化導致P27蛋白的細胞質(zhì)易位，加強P27與14-3-3伴侶蛋白的結(jié)合作用，維持胞質(zhì)中的P27蛋白含量，當細胞進入G1期，P27-S10殘基的磷酸化就成為將P27從細胞核輸出至細胞質(zhì)的強而活躍的信號[16]。S10殘基磷酸化后的P27通過包括CDK5、激酶相關(guān)蛋白等與染色體區(qū)域維持因子 1（chromosome region maintenance factor 1，CRM1）結(jié)合來刺激P27的核出口[17]。在正常滋養(yǎng)細胞中，磷酸化P27-S10只局限于細胞核內(nèi)。向轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染rNodal的滋養(yǎng)細胞中加入野生型P27（P27WT）、P27非磷酸化突變體（P27-S10A）及P27磷酸化模擬突變體（P27-S10D）后發(fā)現(xiàn)Nodal誘導了P27WT的細胞質(zhì)易位，而在細胞質(zhì)中也檢測到P27-S10D的存在，P27-S10A則主要局限于細胞核內(nèi)[12]。在未轉(zhuǎn)染rNodal的滋養(yǎng)細胞細胞質(zhì)中也檢測到P27-S10D的存在，由此證明P27在S10殘基的磷酸化是Nodal調(diào)節(jié)其細胞質(zhì)易位所必需的蛋白修飾[17]。Nodal誘導的P27基因的表達增加及P27/CDK2的細胞質(zhì)易位表明P27在Nodal介導的細胞周期阻滯中發(fā)揮重要作用。

另外，P27也是Nodal調(diào)節(jié)細胞遷移和侵襲的關(guān)鍵介質(zhì)。細胞質(zhì)中的P27與不同蛋白質(zhì)結(jié)合可發(fā)揮促進或抑制細胞遷移的作用。如P27與微管不穩(wěn)定蛋白（Stathmin）結(jié)合可阻止細胞遷移[18]，而與G蛋白超家族成員RhoA結(jié)合則促進細胞遷移[19]。Stathmin是一種細胞結(jié)構(gòu)蛋白，有特有的解聚活性，其高表達與腫瘤的分化、浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)，CDK2/CDK5及磷酸化Stathmin可降低微管不穩(wěn)定活性[20]。P27蛋白在T198位的磷酸化增加了P27的細胞質(zhì)易位，使P27蛋白與RhoA的結(jié)合能力增強[19]。有研究發(fā)現(xiàn)Nodal阻滯P27的T198磷酸化，且促進P27蛋白與Stathmin相互作用[12]。Nodal可增加 P27與 CDK2、CyclinE、CDK5和Stathmin的關(guān)系及Stathmin在S25和S38的磷酸化，且這種效應(yīng)在CDK2/CDK5抑制劑存在的條件下減弱；Nodal信號也可能觸發(fā)P27蛋白和CDK2的輸出，導致P27/CDK2/CDK5/Stathmin的結(jié)合，從而使Stathmin過磷酸化和失活，導致微管蛋白穩(wěn)定，從而減少細胞遷移和侵襲[12，18]。這些證據(jù)表明Nodal有通過調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性抑制滋養(yǎng)層細胞的可能性，其阻滯滋養(yǎng)細胞增殖與侵入的機制可能與P27不同部位的磷酸化及其與不同蛋白質(zhì)結(jié)合有關(guān)。

3.2 調(diào)節(jié)P27蛋白的降解影響細胞增殖內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過P27基因的表達抑制細胞增殖。許多細胞應(yīng)激狀態(tài)（如缺氧、糖基化狀態(tài)改變、鈣離子流異常等）均可導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這是由一系列的未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）介導的信號傳導通路[21]。在哺乳動物細胞中，UPR增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94（GRP94）及轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）的表達，UPR與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶協(xié)同阻滯了G1期細胞周期進展及蛋白質(zhì)的合成[22]。Han等[22]在黑色素瘤細胞中發(fā)現(xiàn)P27基因在介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的G1期細胞阻滯中發(fā)揮關(guān)鍵作用。P27蛋白降解需要依賴泛素-蛋白酶體途徑，泛素連接酶復合體（SCFSKP2）是此降解途徑中使蛋白質(zhì)磷酸化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，S期激酶相關(guān)蛋白2（SKP2）是P27的特異性E3連接酶，有研究證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時P27的積累是由于抑制其多泛素化和蛋白酶體依賴性降解而產(chǎn)生的，且SCF-SKP2使P27的T198位殘基磷酸化而開啟降解過程[23]。在正常細胞中，SKP2水平在G0/G1期最低，S期逐漸增多。SKP2的過表達導致P27的減少，與腫瘤的無限增殖及生存率低有關(guān)[22]。盡管SKP2 有包括 P27、P21、c-myc、E2F1 等在內(nèi)的許多靶點，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激期間P27是SKP2的特異性靶點[22-23]。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/Akt途徑是P27蛋白功能最重要的信號通路，由幾種重要成分組成，包括受體酪氨酸激酶（RTK）、PI3K、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）和Akt等組成。一些受體，如RTK、整合素、細胞因子受體和位于細胞表面（跨膜）的G蛋白耦聯(lián)受體，能夠?qū)⒓毎庑盘栟D(zhuǎn)移到細胞中，導致PI3K/Akt途徑激活。PI3K/Akt信號通路對P27基因的表達有抑制作用，Akt可以直接在T157、T198位殘基上磷酸化P27蛋白，從而阻止P27對CDK-2（160）的抑制活性[24]。蛋白O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶1（proteinO-fucosyltransferase1，poFUT1）通過 PI3K/Akt信號通路增加了滋養(yǎng)細胞中CyclinD、CyclinE的表達，減少P21、P27蛋白水平，促進細胞進入S期[25]。磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶（PFKFB1-4）家族在果糖 6-磷酸（F-6-P）磷酸化為果糖－2，6－二磷酸（F-2，6-BP）的糖酵解調(diào)節(jié)中起著重要作用。有研究證實，PFKFB3也能通過細胞核，其產(chǎn)物F-2，6-BP 能激活 CDK1。F-2，6-BP 刺激 T187 處P27蛋白的磷酸化，從而導致P27蛋白泛素化和蛋白酶體降解[26]。

4 結(jié)語

綜上所述，P27蛋白在腫瘤細胞中具有腫瘤抑制因子（在細胞核內(nèi)）和致腫瘤蛋白（在細胞質(zhì)內(nèi)）的雙重作用。其功能由P27蛋白的細胞核和細胞質(zhì)之間的易位調(diào)節(jié)。P27基因的表達通過與不同因子結(jié)合，影響其翻譯后修飾及亞細胞定位。而在PE患者滋養(yǎng)細胞中，P27在細胞核與細胞質(zhì)中的作用，P27如何影響胎盤滋養(yǎng)細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等能力都有待研究。因此，繼續(xù)揭示P27與PE發(fā)生、進展之間的可能相關(guān)性，為預(yù)防PE的發(fā)生，明確其病因、機制及指導進一步治療具有重要意義。