二型脫碘酶泛素化修飾及其基因多態(tài)性與甲狀腺疾病

孫瑩 姜雅秋

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110001

脫碘酶是含硒蛋白酶，包括一型脫碘酶(D1)、二型脫碘酶(D2)和三型脫碘酶(D3)，它們?cè)诩谞钕偌に卮x過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用。甲狀腺激素的生物活性主要是由D2來(lái)調(diào)控的，D2的外環(huán)脫碘作用主要是通過(guò)泛素化來(lái)完成，泛素化是蛋白質(zhì)的一種降解途徑。D2泛素化與甲狀腺激素的敏感性有關(guān)。因此，其對(duì)甲狀腺功能減退癥的治療效果也有一定的影響。D2基因多態(tài)性也參與甲狀腺激素的轉(zhuǎn)換和代謝，可能會(huì)影響甲狀腺激素水平。因此，D2在甲狀腺疾病中扮演著重要的角色，現(xiàn)就D2泛素化特點(diǎn)、基因多態(tài)性及其與甲狀腺疾病的研究進(jìn)展予以綜述。

1 泛素-蛋白酶體通路

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是真核細(xì)胞中短壽命蛋白質(zhì)的主要降解途徑。UPS在細(xì)胞進(jìn)程包括細(xì)胞周期進(jìn)展、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)抑制等方面調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)。泛素化過(guò)程消耗ATP，能高效、高選擇的降解蛋白質(zhì)。泛素化過(guò)程通常需要3種泛素化酶的協(xié)同作用: 泛素激活酶(E1)、泛素耦聯(lián)酶(E2)和泛素連接酶(E3)[1-2]。

2 D2及其UPS

D2是碘甲狀腺素脫碘酶家族中的一員，為含硒蛋白酶。D2催化外環(huán)碘的脫碘作用，使T4轉(zhuǎn)化為活性更強(qiáng)的T3，影響局部T3的可用性[3-4]。D2催化的T3產(chǎn)生發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，可增加甲狀腺激素信號(hào)，而D2活性降低或影響D2基因表達(dá)會(huì)影響機(jī)體甲狀腺功能。D2的表達(dá)受不同的發(fā)育狀態(tài)、代謝或環(huán)境[如hedgehog途徑、腎上腺素能和G蛋白耦聯(lián)膽汁酸受體1(TGR5)激活的cAMP途徑]、黃酮醇等異種生物分子和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控，這些信號(hào)通過(guò)真核生物翻譯起始因子2α(EIF2α)介導(dǎo)起作用。嚙齒類(lèi)動(dòng)物適應(yīng)性產(chǎn)熱的主要部位是棕色脂肪組織，棕色脂肪組織產(chǎn)熱需要解耦聯(lián)蛋白1(UCP1)的表達(dá)，UCP1受T3的調(diào)節(jié)，D2活性對(duì)于T4到T3的局部轉(zhuǎn)化是必不可少的。研究發(fā)現(xiàn)，D2基因敲除小鼠體溫過(guò)低，必須依靠顫抖來(lái)維持體溫[4]。

D2主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其在正中隆起-弓狀核區(qū)的活性最高。下丘腦D2主要在伸長(zhǎng)細(xì)胞中表達(dá)。腦組織中的T4在D2催化下轉(zhuǎn)化為活性更強(qiáng)的T3。研究表明，腦內(nèi)超過(guò)75%的T3是由D2介導(dǎo)的T4外環(huán)脫碘作用轉(zhuǎn)化而來(lái)[4]。D2缺乏時(shí)，盡管循環(huán)中T3水平正常，但下丘腦中T3含量減少[5]。因此，在下丘腦中發(fā)揮作用的T3部分是從局部T4通過(guò)脫碘轉(zhuǎn)化而來(lái)的。

泛素化和UPS對(duì)于體內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。除了溶酶體途徑外，細(xì)胞也通過(guò)泛素化標(biāo)記并被蛋白酶體吸收來(lái)處理不需要的蛋白質(zhì)。泛素化是可逆的、循環(huán)的、多種酶參與的過(guò)程，該過(guò)程為3種酶介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)：通過(guò)E1激活泛素分子，該過(guò)程為ATP依賴反應(yīng)；活化的泛素轉(zhuǎn)移到E2；通過(guò)含E2和(或)E3的復(fù)合物將目標(biāo)蛋白內(nèi)的賴氨酸殘基多聚泛素化。

D2泛素化具有組織特異性，用L-T4治療的甲狀腺切除大鼠T4向T3的轉(zhuǎn)化率更高，全身組織依賴D2的T3產(chǎn)生減少，但是下丘腦T4向T3的轉(zhuǎn)化受影響最小[6]。特異性敲除星形膠質(zhì)細(xì)胞WSB-1，觀察到與其他組織相比，下丘腦D2泛素化效率更低[7-8]。

3 D2泛素化過(guò)程相關(guān)酶

泛素化過(guò)程的底物通過(guò)靶蛋白與E3家族相互作用。人類(lèi)基因組編碼超過(guò)600種不同的E3，負(fù)責(zé)從原核生物到真核生物的大量底物的泛素化。大部分存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，介導(dǎo)胞質(zhì)或膜結(jié)合底物的泛素化[9]。

D2的泛素化使得D2的二聚體結(jié)構(gòu)發(fā)生構(gòu)象變化而失活。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，D2泛素化的過(guò)程即形成K48-連接的泛素鏈，涉及兩種E3：WSB-1(WD repeat and SOCS box-containing protein 1, WSB-1)和TEB-4[membrane associated ring finger(C3HC4) 6，MARCH 6或TEB-4][10]。泛素化的D2在p97-ATPase的介導(dǎo)下逆向轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中，送入蛋白酶體中被降解[11]。同時(shí)該過(guò)程還有兩種去泛素化酶的參與：泛素特異蛋白酶(USP)20和USP33。

4 D2與下丘腦-垂體-甲狀腺軸

促甲狀腺激素釋放激素(TRH)由下丘腦室旁核神經(jīng)元產(chǎn)生，調(diào)節(jié)垂體促甲狀腺激素(TSH)細(xì)胞的經(jīng)常性活動(dòng)。存儲(chǔ)于下丘腦的TRH經(jīng)垂體門(mén)脈系統(tǒng)作用于TSH細(xì)胞，一是促進(jìn)TSH釋放，二是激活靶基因促進(jìn)TSH合成。TSH分泌增加可促進(jìn)甲狀腺激素的合成和分泌，使循環(huán)血液中甲狀腺激素水平升高，形成一個(gè)負(fù)反饋，抑制TRH和TSH的分泌[12]。由于T4的活性很低，D2在調(diào)節(jié)這個(gè)循環(huán)中扮演著重要的角色，它促進(jìn)血漿T4轉(zhuǎn)化為具有生物活性的T3，并使垂體TSH正常表達(dá)[9]。抗心律失常藥物胺碘酮對(duì)甲狀腺功能有重要影響，主要表現(xiàn)在使TSH水平升高，用胺碘酮處理D2基因敲除小鼠(D2KO)，只有野生型(WT)對(duì)照組的血漿TSH水平出現(xiàn)了預(yù)期約2倍的升高，說(shuō)明D2在這一機(jī)制中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。胺碘酮對(duì)D2信號(hào)通路的破壞可能會(huì)干擾T4信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，使T3產(chǎn)生減少，減弱TSH的反饋機(jī)制。研究還發(fā)現(xiàn)，胺碘酮治療的患者和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清T4和TSH水平往往會(huì)短暫升高，持續(xù)數(shù)月，T4通過(guò)垂體和下丘腦抑制D2活性，在負(fù)反饋環(huán)中發(fā)揮作用，分別減少TSH和TRH的產(chǎn)生，這種表型類(lèi)似于D2KO小鼠。因此，胺碘酮所致TSH水平升高依賴于D2的功能，很可能源于D2在垂體水平受到的抑制[9]。D2在調(diào)節(jié)TRH的作用中也扮演著相似的角色。研究表明，D2誘導(dǎo)產(chǎn)生的T3通過(guò)旁分泌機(jī)制負(fù)反饋調(diào)節(jié)室旁核TRH神經(jīng)元。

5 D2的泛素化修飾與甲狀腺疾病

臨床研究表明，5%～10%用L-T4治療的甲狀腺功能減退癥患者血清TSH水平正常但仍有持續(xù)的癥狀[13]?；颊哂肔-T4治療后，血清T4/T3的比值相對(duì)更高，這一比例的長(zhǎng)期升高對(duì)甲狀腺激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和機(jī)體健康是否有影響還是未知?；谶@種殘余甲狀腺功能減退癥狀的分子基礎(chǔ)的缺乏，研究者構(gòu)建了甲狀腺功能減退癥大鼠模型，分別給予L-T4、L-T3和L-T4+L-T3干預(yù)，檢測(cè)不同組織D2泛素化差異及甲狀腺激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)水平，研究發(fā)現(xiàn)，單純的L-T4治療導(dǎo)致血清T3水平相對(duì)降低和T4/T3比值相對(duì)升高，在垂體和其余的腦組織中，大部分T3主要是由T4通過(guò)D2脫碘作用產(chǎn)生。該通路受D2泛素化程度限制，由于T4可降低D2活性，對(duì)棕色脂肪組織、下丘腦、垂體、小腦、皮質(zhì)、海馬等表達(dá)D2的組織的研究顯示，不同組織D2的泛素化程度存在差異，下丘腦D2的活性受T4的影響最小[6]。通過(guò)構(gòu)建星形膠質(zhì)細(xì)胞泛素化連接酶WSB-1基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn)，在大腦皮層和海馬，WSB-1介導(dǎo)T4誘導(dǎo)的D2失活，在小腦WSB-1不介導(dǎo)T4誘導(dǎo)的D2失活，而在下丘腦，T4對(duì)D2的調(diào)節(jié)作用是最小的。D2在調(diào)節(jié)局部T3的含量中起重要作用。D2半衰期取決于T4的水平[14]。當(dāng)有T4存在時(shí)，其半衰期大約20 min，當(dāng)T4缺乏時(shí)，其半衰期被延長(zhǎng)到幾小時(shí)。當(dāng)血清T4水平較低或碘缺乏或甲狀腺功能減退時(shí)，D2在細(xì)胞中積累會(huì)增加T4向T3的轉(zhuǎn)化。相反，由于T4能夠使D2失活，所以當(dāng)T4水平升高時(shí)，甲狀腺激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能會(huì)減弱。即在有D2表達(dá)的組織中，用L-T4治療的患者血清T4/T3比值升高會(huì)減弱甲狀腺激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

D2在正常甲狀腺中表達(dá)，可能是甲狀腺濾泡細(xì)胞分化的標(biāo)志物。既往的研究已經(jīng)證實(shí)，D2在甲狀腺乳頭狀癌中呈低表達(dá)。早期研究表明，甲狀腺中的D2來(lái)源于濾泡而不是濾泡旁C細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)，D2在甲狀腺髓樣癌(MCT)中高表達(dá)，MCT是一種起源于C細(xì)胞的腫瘤。該研究選取12例MCT患者術(shù)后髓樣癌組織，在12例樣本中均檢測(cè)到D2轉(zhuǎn)錄本，D2活性與正常濾泡組織中相似。對(duì)人MCT細(xì)胞系TT細(xì)胞的進(jìn)一步研究表明，D2的表達(dá)受甲狀腺激素的調(diào)節(jié)而下降，在MCT髓樣癌組織樣本中也發(fā)現(xiàn)甲狀腺激素受體α1和β亞基，提示D2在腫瘤組織局部使T4轉(zhuǎn)化為T(mén)3并發(fā)揮作用[15]。

本課題組大型流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，人群中TSH水平隨著碘攝入量增加而上升[16]?；谶@一結(jié)果所做的基礎(chǔ)研究顯示，D2泛素化在慢性碘過(guò)量所致的TSH水平升高中起重要作用，慢性碘過(guò)量大鼠垂體D2泛素化增強(qiáng)，D2活性下降[17]。

另外，D2單核苷酸多態(tài)性Thr92Ala(rs225014)參與甲狀腺激素的轉(zhuǎn)換和代謝，可能影響甲狀腺激素水平。研究發(fā)現(xiàn)，不是所有患者接受L-T4治療都具有將T4轉(zhuǎn)化為T(mén)3的能力[18]。Torlontano等[13]研究表明，191例分化型甲狀腺癌患者接受甲狀腺全切及放射性碘治療，D2的Thr92Ala多態(tài)性與L-T4的劑量有關(guān)。純合子Ala/Ala攜帶者需要L-T4的水平比非攜帶者高20%左右。然而，Heemstra等[19]的研究沒(méi)有證實(shí)這些結(jié)果，D2的Thr92Ala多態(tài)性與L-T4劑量無(wú)關(guān)。也沒(méi)有觀察到4種D2基因多態(tài)性 (rs225011、rs7140952、rs225012、rs2839858)與患者L-T4劑量有關(guān)[20]。

綜上所述，D2控制著細(xì)胞特異性甲狀腺激素的激活，D2泛素化在維持體內(nèi)甲狀腺激素平衡、發(fā)育和代謝中起重要作用。D2在下丘腦、垂體及其他組織中作用及其機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。D2基因多態(tài)性影響著L-T4治療甲狀腺疾病的效果，其機(jī)制需進(jìn)一步研究。