蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及其在中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥研究的應(yīng)用進(jìn)展

白璧輝， 謝興文， 李鼎鵬， 黃晉， 徐世紅

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅蘭州 730050；3.甘肅省中醫(yī)院，甘肅蘭州 730050）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是以骨的含量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)退化表現(xiàn)，致使增加了骨的脆性，導(dǎo)致易于發(fā)生骨折的一種全身性代謝疾病[1]。OP好發(fā)于中老年人。近年來(lái)，有關(guān)OP的防治更加規(guī)范細(xì)致，中西藥物治療能夠顯著增加患者的骨密度及骨強(qiáng)度，但不能使OP患者的骨重塑過(guò)程恢復(fù)平衡。新研發(fā)的促進(jìn)骨合成的藥物在刺激新骨形成的同時(shí)也刺激了骨吸收，導(dǎo)致其療效并不穩(wěn)定。而針對(duì)激素水平進(jìn)行治療的藥物由于靶向性不強(qiáng)，難以進(jìn)行根本性治療，且某些藥物的不良反應(yīng)較多，甚至?xí)霈F(xiàn)安全性問(wèn)題。目前OP治療存在的不足，凸顯開展OP早診斷、早預(yù)防的意義。利用蛋白質(zhì)組學(xué)易感蛋白的定量技術(shù)，可以揭示OP每一階段的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)理，特別是血清蛋白的表達(dá)改變，對(duì)于早診斷和早預(yù)防OP病變過(guò)程，具有重要的意義。中醫(yī)也逐漸將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于OP的探究中，以探索中醫(yī)OP證候分型與蛋白質(zhì)的相關(guān)性以及中醫(yī)藥治療OP的蛋白質(zhì)水平作用途徑。以下通過(guò)概述蛋白質(zhì)組學(xué)在中醫(yī)藥治療OP的應(yīng)用現(xiàn)狀，以期為中醫(yī)藥防治OP提供理論基礎(chǔ)。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)概述

蛋白質(zhì)是生物生理功能的全面表達(dá)者，其結(jié)構(gòu)和功能的研究能夠幫助研究者發(fā)現(xiàn)生命體在病理狀態(tài)下的發(fā)展規(guī)律并闡述其病變機(jī)理。對(duì)于研究OP者，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為一種非常有針對(duì)性的研究目標(biāo)細(xì)胞和組織的工具[2]。目前生命科學(xué)的重點(diǎn)也已經(jīng)轉(zhuǎn)移到了蛋白質(zhì)的研究上。蛋白質(zhì)能夠比基因更全面地反映生命體的功能及各種作用機(jī)制，而且蛋白質(zhì)是細(xì)胞代謝最主要的執(zhí)行者，同時(shí)也作為靶分子作用于多種致病因子。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以直接分析生物樣本如血清、尿液、腦脊液等，能夠客觀準(zhǔn)確地反映血清中絕大多數(shù)蛋白的含量[3]。隨著分子技術(shù)的蓬勃興起，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為尋找疾病的生物標(biāo)志物提供了方向[4]。蛋白質(zhì)組學(xué)可表達(dá)更全面的疾病信息，更加接近生命體本質(zhì)的生理和病理狀態(tài)。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)比較不同狀況下細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的數(shù)量及位置的差異，尋找疾病的特異蛋白質(zhì)，可為疾病的發(fā)生機(jī)制與診斷提供不同的標(biāo)識(shí)，為新藥研發(fā)提供指導(dǎo)。因而，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究有著廣泛的臨床及應(yīng)用前景。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)常用技術(shù)

2.1蛋白質(zhì)分離技術(shù)蛋白質(zhì)的分離技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要部分，主要包括雙向凝膠電泳技術(shù)（2-DE）、雙向熒光差異凝膠電泳（2D-DIGE）技術(shù)、高效液相色譜技術(shù)（HPLC）、雙向HPLC（2D-HPLC）技術(shù)、親和層析、毛細(xì)管電泳等6種分離技術(shù)，可用來(lái)分析從細(xì)胞、體液或組織中提取的復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物。根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，可分離數(shù)千種不同的蛋白質(zhì)組成的復(fù)雜混合物，并可確定每種蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。經(jīng)過(guò)分離蛋白質(zhì)樣品后，可得到分子的等電點(diǎn)及含量?jī)煞矫娴男畔ⅰ?/p>

2.2蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)現(xiàn)在普遍應(yīng)用的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)為生物質(zhì)譜分析技術(shù)，主要包括早期的基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜（MALDI-MS）、電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI-MS）、表面增強(qiáng)激光解吸離子化質(zhì)譜（SELDI-MS），以及后期改良的表面增強(qiáng)激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）技術(shù)、同位素標(biāo)記術(shù)和標(biāo)簽技術(shù)（ICAT）、蛋白質(zhì)芯片（protein chips）等。由于該類技術(shù)具有迅速、靈敏、準(zhǔn)確以及高通量、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，并能進(jìn)行蛋白質(zhì)序列分析和翻譯后修飾的分析（糖基化、磷酰化），現(xiàn)已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中分析與鑒定肽和蛋白的最重要的手段。

2.3生物信息學(xué)目前生物信息學(xué)已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中重要構(gòu)成部分，研究人員已經(jīng)為此建立了多個(gè)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的數(shù)據(jù)庫(kù)，最常用的3種為SWISS-PROT、EMBL和GEO，其中SWISS-PROT是最大、種類最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。研究者通過(guò)在蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找與對(duì)比，可更全面地獲取蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，從而更系統(tǒng)高效地進(jìn)行分析，起到對(duì)比鑒定的作用。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥治療OP中的應(yīng)用

3.1單味中藥大量研究表明單味中藥對(duì)OP的治療具有良好的效果。用于治療OP的中藥主要包括杜仲、熟地黃、淫羊藿、仙茅、骨碎補(bǔ)等。目前已提取多種中藥的有效成分用于治療，但對(duì)于其機(jī)理的探討仍較為匱乏。對(duì)于單味中藥治療OP作用機(jī)理的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，曾建春等[5]分析了杜仲誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制，通過(guò)電泳分離得到641個(gè)蛋白點(diǎn)，并選取了其中的75個(gè)進(jìn)行質(zhì)譜分析，證明杜仲可通過(guò)6個(gè)功能蛋白調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖與分化，從而達(dá)到治療OP的效果；薛黎明[6]運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究淫羊藿、仙茅單味藥防治OP的作用機(jī)理，結(jié)果顯示，淫羊藿中的總黃酮、仙茅中的苯甲酸酯類總酚苷能明顯改善OP導(dǎo)致的尿液和血液代謝產(chǎn)物的變化，并參與能量、氨基酸和脂肪的代謝以及氧化應(yīng)激、細(xì)胞骨架形成，同時(shí)發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷和仙茅苷及其配伍可改善成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的線粒體膜電勢(shì)和三磷酸腺苷（ATP）含量。骨碎補(bǔ)主要通過(guò)調(diào)控骨代謝相關(guān)分子及骨形成蛋白通路上相應(yīng)的靶點(diǎn)，發(fā)揮抑制骨吸收及促進(jìn)骨形成的作用，最終達(dá)到治療OP的目的[7]。

3.2中藥復(fù)方治療OP的中藥復(fù)方主要包括左歸丸、六味地黃丸、獨(dú)活寄生湯、二仙湯等經(jīng)典名方。相關(guān)的臨床實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道此類復(fù)方可通過(guò)促進(jìn)骨骼礦化，維持骨代謝平衡，達(dá)到減輕臨床癥狀，提高治療效果的目的。盧嚴(yán)方等[8]運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)美國(guó)國(guó)家生物信息中心（NCBI）中的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中六味地黃丸治療絕經(jīng)期腎陰虛OP的相關(guān)信息進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)六味地黃丸在治療腎陰虛型OP絕經(jīng)期患者時(shí)，其基因TNP1和MAP3K10的表達(dá)明顯增加，而ZNF家族基因和XRN1、XPO1、NUP54等基因的表達(dá)顯著下降；故認(rèn)為該復(fù)方通過(guò)促進(jìn)雌激素表達(dá)及與其受體結(jié)合，保持免疫應(yīng)答平衡而促進(jìn)骨組織形成，從而達(dá)到改善骨代謝作用。而陳娟等[9]采用傳統(tǒng)的免疫組化研究，發(fā)現(xiàn)六味地黃丸治療腎陰虛型OP絕經(jīng)期患者是通過(guò)調(diào)控JAK/STAT通路中IRF1基因信號(hào)干預(yù)免疫功能而實(shí)現(xiàn)的。以上文獻(xiàn)分析表明蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比免疫組化方法的研究結(jié)果更加全面，并有助于進(jìn)一步的探析。

對(duì)于二仙湯、左歸丸、壯骨止痛方作用機(jī)制的研究，劉志文等[10]研究二仙湯對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠股骨蛋白質(zhì)組的影響，檢測(cè)股骨組織蛋白，通過(guò)定量分析差異表達(dá)蛋白的強(qiáng)度，共發(fā)現(xiàn)41種差異表達(dá)蛋白（主要包括生物氧化相關(guān)蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)蛋白等），發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)如碳酸酐酶2和整合素β1是二仙湯的作用靶點(diǎn)。張穎等[11]對(duì)去卵巢OP大鼠的雙側(cè)股骨骨髓進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向電泳并對(duì)其電泳圖譜進(jìn)行分析，篩選出與左歸丸療效的相關(guān)蛋白，并進(jìn)行質(zhì)譜分析，共篩選出23個(gè)差異蛋白點(diǎn)，鑒定出其中的11個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，包括果糖酸縮酶A、抗氧化蛋白6、α烯醇化酶、烯醇化酶3、白蛋白、鈣網(wǎng)蛋白、蛋白二硫化物異構(gòu)酶A3等；發(fā)現(xiàn)左歸丸通過(guò)調(diào)節(jié)含以上相關(guān)蛋白的細(xì)胞的增殖、分化、代謝、凋亡等來(lái)治療OP。楊軍等[12-13]對(duì)去卵巢大鼠OP模型股骨的蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳，獲得各組總蛋白質(zhì)的圖譜，用圖像分析各組間差異蛋白質(zhì)點(diǎn)并結(jié)合蛋白質(zhì)生物信息庫(kù)（MLD），對(duì)各蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)X1（胰島素受體蛋白）、X2（熱休克同源蛋白）、X3（分泌顆粒素Ⅱ）這3種差異蛋白在壯骨止痛方治療OP的過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

3.3針刺治療針灸作為臨床上的常用治療方法，能夠從整體或多臟腑進(jìn)行靶點(diǎn)性的全面治療，療效肯定并具有安全性高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在治療OP方面具有一定的優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)針灸治療OP能夠抑制破骨細(xì)胞關(guān)鍵調(diào)控因子OPG和RANKL mRNA表達(dá)，刺激成骨細(xì)胞特異基因CB1 mRNA表達(dá)，調(diào)節(jié)骨量平衡，同時(shí)通過(guò)提高Ⅰ型膠原氨基端延長(zhǎng)肽水平及降低β-Ⅰ型膠原羧基端肽來(lái)改善臨床癥狀[14-15]。秦瑋等[16]采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析針刺命門穴治療絕經(jīng)后OP的機(jī)制：以電針刺激去卵巢OP大鼠命門穴，觀察去卵巢OP大鼠下丘腦骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smad1/5表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用免疫組化法檢測(cè)下丘腦BMP-2及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smad1/5的表達(dá)。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組下丘腦BMP-2及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smad1/5陽(yáng)性細(xì)胞總面積、陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值與兩個(gè)模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果不僅為針刺命門穴治療絕經(jīng)后OP提供一定的理論依據(jù)，而且為運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究針刺治療OP的作用機(jī)制提供了思路與方法。

4 討論

關(guān)于OP發(fā)病機(jī)理，目前認(rèn)為其機(jī)制與骨的抑制、吸收及骨形成之間的失衡有關(guān)，研究多集中在基因水平，如OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)、Wnt/βcatenin 途徑、Cbfa1、Osterix、Runx、Cathepsin K等轉(zhuǎn)錄因子及酶的作用機(jī)制已經(jīng)逐漸被揭示，但大多以單基因或小基因、單通路或小通路研究為主，未能從整體蛋白質(zhì)水平去探索發(fā)病規(guī)律[17]。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究能直接反映1個(gè)基因組或者1種細(xì)胞/組織中攜帶的信息及所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)是完成生命活動(dòng)的最終形式，能比基因更加真實(shí)全面地反映生物體的功能及各種作用機(jī)制[18-19]。中醫(yī)學(xué)相對(duì)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雖然對(duì)疾病的微觀認(rèn)識(shí)和處置方法有所不同，但中醫(yī)也逐漸將蛋白質(zhì)組學(xué)方法應(yīng)用于疾病的研究。采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選和鑒定血清中OP狀態(tài)和正常生理狀態(tài)下的差異表達(dá)蛋白，將有利于OP的發(fā)生機(jī)理的闡明，為中醫(yī)藥早期診斷與及時(shí)治療OP提供理論基礎(chǔ)，并為后期研發(fā)針對(duì)OP人群的治療藥物提供依據(jù)。

目前針對(duì)中醫(yī)藥治療OP的蛋白質(zhì)組學(xué)研究還比較少，且以在體動(dòng)物和離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)為主，文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)量不多。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的改進(jìn)及其在OP防治領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用，將會(huì)進(jìn)一步發(fā)掘出與OP疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)。探究引起OP的蛋白質(zhì)組成，揭示差異蛋白影響OP發(fā)生的機(jī)理，并利用蛋白質(zhì)組學(xué)的現(xiàn)代化技術(shù)對(duì)中醫(yī)辨證分型進(jìn)行探究，利用生物信息學(xué)資料比較分析實(shí)現(xiàn)微觀辨證分型，將對(duì)促進(jìn)對(duì)OP早期診斷和預(yù)防、及時(shí)治療和中醫(yī)藥現(xiàn)代化具有重大意義。