人參thionins的克隆、原核表達(dá)和活性研究

張鵬飛 邊帥 趙月 趙雨 王佳雯

（長春中醫(yī)藥大學(xué) 吉林省人參科學(xué)研究院，長春 130117）

人參（Panax ginsengC. A. Mey）是東北重要的藥用植物，具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、治療心血管、糖尿病及腦部疾病等多種藥理作用［1-6］。然而人參的生長周期過長，在其生長過程中受到多種病害的侵?jǐn)_［7-8］，目前主要方法是噴灑農(nóng)藥，但易使病原體產(chǎn)生耐藥性并帶來農(nóng)藥殘留。研究抗菌肽［9］類的生物農(nóng)藥是解決這些問題的辦法之一，能夠提高人參的產(chǎn)量，帶來良好的經(jīng)濟(jì)效益。近年來多種植物抗菌肽被發(fā)現(xiàn)并研究。硫堇蛋白是一種廣泛存在于植物細(xì)胞，具有廣譜抑菌效果的小分子多肽。目前人參硫堇蛋白的抗菌效果尚未報(bào)道。前期通過人參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行人參發(fā)病情況及抗菌肽表達(dá)量的相關(guān)性分析，篩選發(fā)現(xiàn)人參硫堇蛋白的表達(dá)與人參病害有著密切的關(guān)系。本研究擬通過構(gòu)建人參硫堇蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中進(jìn)行蛋白表達(dá)并純化，驗(yàn)證人參硫堇蛋白的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料

表達(dá)載體pGEX-4T1、E.coliDH5α菌株、E.coliBL21由長春中醫(yī)藥大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室保存，黑斑菌菌株由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院提供。限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒等購自TaKaRa公司；鎳離子親和層析預(yù)裝柱和Amicon Ultra-15 10K超濾管購自GE公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純或進(jìn)口分裝試劑。硫堇蛋白成熟肽基因由長春華大中天生物技術(shù)有限公司合成并連入亞克隆載體中。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 將合成的pMD-18T-thionins質(zhì)粒和原核表達(dá)載體pGEX-4T1分別進(jìn)行BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，回收。用T4 DNA連接酶16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，接種氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的優(yōu)化 將鑒定正確的pGEX-4T1-thionins質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，接種氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，挑單克隆至試管，過夜培養(yǎng)，按照1∶100的比例接種到LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，共9份，編號為1-9。1號為不加IPTG的空白對照；2-9號分別加入終濃度為0.1、0.3、0.5、0.6、0.8、1.0、1.5和2.0 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。并分別在誘導(dǎo)3、5和8 h時(shí)取1 mL菌液進(jìn)行SDS-PAGE。比較在不同IPTG濃度、不同誘導(dǎo)時(shí)間目的蛋白的表達(dá)情況，篩選出最佳誘導(dǎo)條件。

1.2.3 SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色 取1 mL菌液于EP管中，10 000 r/min離心1 min，去上清，沉淀使用100 μL ddH2O重懸，取20 μL重懸液加入20 μL電泳上樣緩沖液并煮沸10 min致蛋白變性，使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行樣品分離。用考馬斯亮藍(lán)染色液37℃染色15 min。用脫色液將其脫色至可見清晰條帶，使用凝膠成像儀進(jìn)行分析。

1.2.4 蛋白純化 將誘導(dǎo)后離心收集的菌體沉淀，經(jīng)PBS洗滌2次，細(xì)胞裂解液裂解菌體，加入PMFS和溶菌酶，冰上攪拌20 min，加入脫氧膽酸鈉37℃攪拌10 min，冰上超聲破碎30 min，最后加入核酸酶，37℃反應(yīng)30 min，其間不斷震蕩至液體不再黏稠。液體10 000 r/min離心20 min，收集包涵體沉淀。使用包涵體洗滌液洗滌沉淀，包涵體溶解液（含1.5%十二烷基肌氨酸鈉）溶解沉淀，0.22 μm濾膜過濾，使用1 mL Ni-NTA柱純化，結(jié)合液（含10 mmol/L咪唑）洗滌去除雜蛋白，使用50 mmol/L咪唑緩沖液將目的蛋白從柱上洗脫，收集洗脫液。將純化后的蛋白溶液放入透析袋中梯度透析，透析液為分別含有0.8%、0.6%、0.3%和0.1%十二烷基肌氨酸鈉（SKL）的磷酸鹽緩沖液，0.1×PBS透析36 h。最后使用超濾管濃縮蛋白。

1.2.5 免疫印跡法 SDS-PAGE后，使用半干轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。置于5%的脫脂牛奶室溫封閉30 min；PBST漂洗后一抗4℃孵育過夜；PBST漂洗3次，加入二抗室溫孵育45 min；PBST漂洗3次，加入顯色底物，至特異性條帶清晰可見時(shí)，終止反應(yīng)。

1.2.6 紙片擴(kuò)散法 將新華1號定性濾紙剪成6 mm直徑的圓形小紙片并滅菌。將黑斑菌菌塊接種到PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，待菌絲生長到一定程度，將紙片均勻的貼在培養(yǎng)基上，保證各濾紙片距離中心的距離一致。向?yàn)V紙片滴加人參硫堇蛋白溶液，空白加入GST蛋白溶液。放入28℃恒溫箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，定期觀察抑菌情況。生長抑制率（%）=1-（GST組真菌生長半徑r0（cm）-硫堇蛋白組真菌生長半徑r?。╟m））/GST組真菌生長半徑r0（cm）×100%。

1.2.7 半數(shù)抑制濃度（IC50）試驗(yàn) 將菌塊接種到液體土豆培養(yǎng)基（PDB）中，28℃、160 r/min震蕩培養(yǎng)3 d。然后用8層紗布過濾，利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基將孢子稀釋到約3×104孢子數(shù)/mL，96微孔板每孔加入90 μL孢子稀釋液以及10 μL不同濃度的人參硫堇蛋白溶液，混勻，28℃暗培養(yǎng)，36 h時(shí)使用酶標(biāo)儀在595 nm波長下，記錄各孔吸光度值，計(jì)算抑菌率，得出半數(shù)抑制濃度。計(jì)算公式抑菌率（%）=（空白組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/空白組OD值×100。

1.2.8 質(zhì)膜通透性試驗(yàn) 96微孔板每孔加入100 μL孢子稀釋液（濃度同上），同時(shí)加入終濃度為14 μmol/L的人參硫堇蛋白和25 μmol/L SYTOX綠色熒光染料，并設(shè)無蛋白的空白組，在25℃孵育30 min。用熒光顯微鏡觀察對質(zhì)膜的透化作用。

2 結(jié)果

2.1 人參thionins的序列分析

從NCBI中獲得人參thionins序列，長度228 bp，編碼75個(gè)氨基酸，預(yù)測分子量為5.16 kD，預(yù)測等電點(diǎn)為9.3，二級結(jié)構(gòu)包括29.33% α-螺旋、12%延伸鏈、8% β-轉(zhuǎn)角和50.67%無規(guī)卷曲。根據(jù)Signalp-4.1Signalp analysis軟件分析，人參thinoins蛋白的1-28位氨基酸為前導(dǎo)肽序列（圖1下劃線處）。選取其成熟肽區(qū)域（29-75 aa）進(jìn)行后續(xù)的表達(dá)和純化。

圖1 人參硫堇蛋白的結(jié)構(gòu)分析

2.2 人參thionins原核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

對人參thinoins的成熟肽部分基因進(jìn)行人工合成，為了后續(xù)純化在C末端加入6×His標(biāo)簽。將目的片段連入原核表達(dá)載體pGEX-4T1中。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。質(zhì)粒線性大小約為5 000 bp，但由于質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)，在電泳結(jié)果呈現(xiàn)出2 000-3 000 bp大小的條帶。經(jīng)雙酶切鑒定，在5 000 bp和100-250 bp兩處可見特異性條帶，分別為pGEX-4T1線性片段及thinoins片段（圖2），證明pGEX-4T1-thinoins構(gòu)建成功。

圖2 原核表達(dá)載體pGEX-4T1-thinoins的雙酶切鑒定

2.3 人參硫堇蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件，獲得最佳誘導(dǎo)方法：菌種過夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接于20 mL培養(yǎng)基中，37℃200 r/min震蕩培養(yǎng)，待OD600值達(dá)到0.6-0.8，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，5 h后終止誘導(dǎo)。經(jīng)SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)檢測分析，結(jié)果（圖3）顯示，在約33 kD處有一特異表達(dá)的蛋白帶，與預(yù)期的人參GST-thinoins-His融合蛋白的大小基本一致，表明成功誘導(dǎo)了融合蛋白。

圖3 人參硫堇蛋白表達(dá)形式檢測結(jié)果

2.4 人參硫堇蛋白的純化和除鹽

誘導(dǎo)后裂解菌體，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDSPAGE檢測蛋白表達(dá)形式，特異性條帶出現(xiàn)在沉淀中，說明重組蛋白以包涵體的形式存在（圖3）。溶解包涵體后，使用HisTrap FF柱進(jìn)行分離純化。當(dāng)洗脫液中咪唑濃度為50 mmol/L時(shí)，目的蛋白被充分洗脫（圖4）。洗脫液放入透析袋中梯度透析除鹽。由于純化后蛋白在25 kD處有另一條帶，對純化蛋白進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果與考馬斯亮藍(lán)結(jié)果類似，anti-GST抗體和anti-His抗體在33 kD和25 kD處均能檢測得到目的蛋白（圖4），說明25 kD處的條帶可能是重組蛋白的不同剪切形式。

圖4 人參硫堇蛋白純化及檢測結(jié)果

2.5 人參硫堇蛋白的抗真菌活性

通過對人參進(jìn)行土傳真菌黑斑菌的體外抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果（圖5）表明，人參硫堇蛋白在3和9 μmol/L濃度時(shí)對黑斑病菌絲的生長具有明顯的抑制作用（形成抑菌圈）。根據(jù)公式計(jì)算生長抑制率分別為36.0%和51.1%。使用黑斑孢子來檢測重組蛋白的半數(shù)抑制濃度，結(jié)果如表1所示，利用不同蛋白濃度的抑菌率來繪制趨勢線，利用公式計(jì)算得出重組蛋白對黑斑孢子的半數(shù)抑制濃度為0.87 μmol/L。質(zhì)膜通透性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)硫堇蛋白處理過的黑斑孢子，SYTOX熒光染料可進(jìn)入孢子內(nèi)與DNA結(jié)合，發(fā)出綠色熒光，而空白組在顯微鏡下則沒有熒光（圖6）。說明人參硫堇蛋白可以誘導(dǎo)黑斑孢子質(zhì)膜通透性發(fā)生改變進(jìn)而達(dá)到抑菌效果。

趨勢線公式y(tǒng)=47.69x+8.51

圖5 人參硫堇蛋白抑制黑斑病菌生長

表1 不同蛋白濃度的抑菌率

圖6 人參硫堇蛋白改變黑斑病菌孢子細(xì)胞膜通透性

3 討論

植物在生長過程中不可避免地受到多種病原微生物的影響，在長期的進(jìn)化過程中，植物形成了獨(dú)特的防御機(jī)制來抑制病原微生物的侵染和傳播。其中，大量表達(dá)抗菌肽是一種重要的防衛(wèi)機(jī)制?？共《镜鞍缀投嚯陌◣锥≠|(zhì)酶、防御素和類防御素蛋白、親環(huán)素蛋白、葡聚糖酶、過敏多肽、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白、硫堇蛋白和過氧化物酶等［10-14］。其中，硫堇蛋白已經(jīng)在至少15種植物中被分離出來并鑒定［15-17］。

本研究使用分子生物學(xué)手段成功構(gòu)建了人參硫堇蛋白成熟肽的原核表達(dá)質(zhì)粒，選擇這一部分蛋白來單獨(dú)表達(dá)是由于通過軟件分析蛋白N端具有一個(gè)前導(dǎo)肽，表達(dá)后引導(dǎo)蛋白定位在細(xì)胞壁上，之后前導(dǎo)肽被剪切下來。因此發(fā)揮作用的硫堇蛋白應(yīng)該是切除了前導(dǎo)肽的成熟肽部分。本研究采用原核表達(dá)載體pGEX-4T1，該載體上帶有GST融合蛋白，能夠增加重組蛋白的可溶性和表達(dá)量［18］，同時(shí)，由于多數(shù)物種的硫堇蛋白具有抑菌活性，為了防止人參硫堇蛋白在大腸桿菌中表達(dá)造成毒性產(chǎn)生菌體自溶，加入融合蛋白可以中和這一毒性［19］。在本研究中，GST沒能增加重組蛋白的可溶性，但是中和了硫堇蛋白的毒性，重組蛋白以包涵體形式成功表達(dá)。另外，在C端加入6×His標(biāo)簽，便于包涵體蛋白變性后親和純化。硫堇蛋白的成熟肽部分具有多個(gè)半胱氨酸，其是否能夠形成二硫鍵是未知的，而通過變性后復(fù)性的純化方法能否破壞二硫鍵進(jìn)而影響蛋白功能也是需要研究的一個(gè)部分。未來可以通過人工合成該多肽，然后分析活性、高分辨質(zhì)譜精確分子量并進(jìn)行肽指紋圖譜分析，進(jìn)一步了解其構(gòu)象和功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，多種抗菌肽的抗菌機(jī)制為在靶細(xì)胞膜上形成離子通道，使細(xì)胞膜兩側(cè)的膜電位發(fā)生改變，靶細(xì)胞因滲透壓改變，水溶性物質(zhì)滲出而死亡［20］。本研究純化的重組硫堇蛋白能夠特異性的抑制黑斑病真菌的生長，且機(jī)制為改變真菌細(xì)胞膜的通透性，符合大部分抗菌肽的抗菌機(jī)制。

4 結(jié)論

成功克隆了人參thionins，thionins蛋白體外具有活性，能抑制黑斑病菌的生長。